Tg 3 свд: Карабин КК TG3: гладкоствольная СВД

Содержание

Карабин КК TG3: гладкоствольная СВД

Карабин КК TG3 идейно продолжает линейку гладкоствольных адаптаций бестселлеров Концерна Калашникова, конкретно — гладкоствольную версию знаменитой снайперской винтовки Драгунова, а точнее ее гражданской версии “Тигр”.

Конструктивные различия с оригиналом у нее минимальны, а стрелковые характеристики стрельбы на дистанциях до 250-300 метров далеко превосходят все гладкоствольные аналоги на рынке. 

Почему же TG3 — уникальный в своем роде продукт, читайте в нашем обзоре.

Конструктивные особенности TG3

О всех отличиях гражданских карабинов “Тигр” от армейской винтовки СВД мы уже ранее писали, прочесть о них можно тут. Здесь же упомянем различия гладкоствольного карабина TG3 и базы на которой он сделан — нарезного карабина “Тигр” СОК5.

Первое и самое главное отличие — ствол в сверловке Ланкастера. У нас есть большая статья о том, что это такое, прочесть ее можно здесь. Вкратце лишь скажем что такая сверловка позволяет приблизится к показателям кучности нарезного оружия на коротких и средних дистанциях. Ствол чуть толще, чем у нарезного карабина — это обусловлено мощностью патрона 9,6/53, которая превосходит традиционный СВДшный 7,62х54: 4000 джоулей против 3400.

Также немного изменился и газблок — в TG3 он не регулируется, и настроен на работу автоматики с валовым патроном. 


Третье серьезное изменение — магазин оружия. Карабин питается от своих собственных однорядных пятиместных магазинов, магазины от “Тигра” не подойдут. Однорядная конструкция — вынужденная мера, так как патрон 9,6/53 плохо подается при двухрядном расположении. Также, из-за изменения конструкции магазина, затвор не становится на затворную задержку в крайнем положении при пустом магазине.

Во всем остальном, включая вес, габариты, обвес, конструкцию ДТК и тыльника TG3 полностью соответствует “Тигру”. Кстати, из-за того что ДТК и тыльник рассчитаны на менее мощный патрон, с патроном 9,6/53 они работают плохо, и карабин ощутимо лягается. Особенно забавляет разметка целика до 1200 метров, что было сделано в угоду внешней аутентичности карабина — разумеется ни на какие 1200 метров он не стреляет, а тем более с открытого прицела.

Стрелковые характеристики

Оружие со сверловкой Ланкастера занимает интересную нишу: оно позволяет начинающим стрелкам пробовать себя в охоте и точной стрельбе на дистанции 100-300 метров по гладкоствольной, “зеленой” лицензии; как говорят в народе “с пользой скоротать 5 лет в ожидании стажа на нарезное”. И действительно, по баллистике на среднюю дистанцию TG3 не сильно отличается от своего нарезного брата:


100м группа из 5 выстрелов

200м группа из 5 выстрелов

300м группа из 5 выстрелов

“Тигр” 

Патрон БПЗ 7,62х54 

Пуля FMJ 11,3гр.

34 мм

88 мм

127мм

TG3

Патрон ТКМ 9,6/53

Пуля FMJ 15гр.

42 мм

140 мм, существенное падение СТП на 200мм.

370мм,

Падение СТП больше 500мм.

Как видите, на небольших дистанциях 100-150 метров его кучность почти не отличается от нарезного, однако на дистанциях свыше 200 метров помимо резкого падения кучности, падает еще и средняя точка попадания. Особенно это заметно на дистанциях 300+ метров — оружие стреляет практически по навесной траектории. 

При этом скорость пули на всей траектории падает незначительно, и она сохраняет свою убойную энергетику даже несмотря на падение траектории — в теории это позволяет охотиться на предельных дистанциях, в случае если вы быстро сможете подобрать вертикальные поправки.

Еще один недостаток — гуляющая навеска пороха даже внутри одной упаковки патронов, скорость может отклоняться на 20 метров в секунду в обе стороны. Разумеется, точности это не прибавляет, хотя в целом картина весьма неплохая.

Для чего подходит TG3

Учитывая все вышесказанное, можно порекомендовать карабин TG3 всем оружейным энтузиастам, не накопившим стаж на нарезное — из всего “псевдонарезного” оружия TG3 имеет одни из лучших баллистических характеристик благодаря длине ствола и мощности патрона.  

Он подойдет для всех видов охот, в том числе на хищника и крупных копытных — этому способствует энергетика патрона и хорошая кучность на небольших, ”охотничьих” дистанциях в 100-150 метров. 

Относительно высокая цена выстрела, почти вдвое большая в сравнении с нарезным 7,62х54, не располагает к развлекательной стрельбе из TG3, однако тренироваться в точной стрельбе из него вполне реально. Вы можете упражняться в стрельбе по 30-сантиметровым гонгам на дистанциях до 250 метров.

Модификации карабина TG3

На данный момент существует несколько модификаций карабина. 

Исполнение 01

Базовое исполнение карабинов TG3, полностью соответствует карабину “Тигр” СОК 5 по внешнему виду и обвесу. Бывает в версиях с полимерным и деревянным ложе, которые отличаются по цене и комфорту использования: пластик практичнее, но дерево традиционно приятнее для вкладки и выглядит более эстетично.

Исполнение 01 со стволом 530мм

Версия стандартного карабина с укороченным стволом: 530мм вместо 620мм. Теоретически, такой карабин будет более удобен на охоте, так как короткий ствол позволяет быстрее вскинуться, и с ним легче пробираться сквозь заросли. 

Исполнение 02

Версия карабина на основе “Тигр” 02, сделанной идентичной армейской складной версии винтовки Драгунова — СВДС. Складной приклад позволяет значительно снизить габариты карабина при транспортировке, но вести огонь со сложенным прикладом не выйдет — на основании приклада установлен блокиратор спуска в соответствии с законодательством РФ.


Справочная статья основана на экспертном мнении автора

Автор материала Богдан Кодаш

Самозарядное гладкоствольное ружье Калашников TG3 (Россия)

Гладкоствольное ружье TG3 (официальное название Гладкоствольный полуавтоматический карабин TG3) разработано концерном Калашников на базе самозарядной винтовки Драгунова СВД. Ружье впервые представлено широкой публике летом 2018 года на выставке «Армия 2018», его продажи должны начаться в 2018 году.

 

Гладкоствольное ружье Калашников TG3 на выставке Армия-2018

 

Ружье TG3 создано для того, чтобы предоставить российским стрелкам и охотникам самозарядное оружие, формально классифицируемое как гладкоствольное, но при этом имеющее баллистику на уровне серьезных охотничьих карабинов с нарезным стволом. Для этого ружье имеет ствол с овальной сверловкой Ланкастера и в нем применяются патроны 9.6/53 Ланкастер разработки компании «Техкрим». Эти патроны созданы на базе гильзы винтовочного патрона 7.62х54R, дульце которой развернуто под пулю с диаметром 10.3мм (номинальный калибр 9.6мм взят по наименьшей из осей эллипса, образующего сечение ствола со сверловкой типа Ланкастер).

сечение ствола со сверловкой Ланкастера

 

Нужно отметить что номинальные характеристики патрона 9.6/53 Ланкастер весьма впечатляют — при массе пули 14.8 грамма ее начальная скорость заявляется на уровне 700 м/с, что дает дульную энергию порядка 4000 Дж. На дистанции в 250 метров эта пуля будет иметь энергию порядка 1400 Дж, а при стрельбе с пристрелкой на 100 метров снижение траектории на 250 метрах относительно точки прицеливания составит порядка 50 см. Точность стрельбы TG3 позволяет уверенно поражать стальной 30-см гонг на дистанции до 300 метров.

Сверловка Ланкастера (Lancaster oval bore rifling), впервые предложенная англичанином Чарльзом Ланкастером (Charles Lancaster) в середине 19 века, отличается тем, что в стволе нет четко выраженных нарезов (долов и полей). Канал ствола в поперечном сечении имеет вид овала, оси которого вращаются вокруг продольной оси, создавая спираль, закручивающую пулю. Такая сверловка изначально была предложена для артиллерийских орудий и хорошо работает только при сравнительно больших калибрах и умеренных скоростях снаряда (пули). По российскому законодательству стволы со сверловкой Ланкастера формально считаются «гладкоствольными».

Ружье TG3 в исполнении с деревянной ложей по типу СВД

 

Ружье TG3 предлагается в трех вариантах исполнения. Базовый вариант выполнен по типу классической винтовки СВД, с деревянным рамочным прикладом, деревянным цевьем и съемной щекой на прикладе. Вариант TG3исполнение 01 имеет пластиковые рамочный приклад и цевье, а вариант TG3 исполнение 02 имеет складной вбок металлический приклад по типу винтовки СВДС и пластиковое цевье.

 

вид на однорядный магазин для TG3 в корпусе магазина от СВД

 

Само ружье TG3 по конструкции повторяет охотничий карабин «Тигр», созданный на базе снайперской винтовки Драгунова СВД. В нем используется газоотводная автоматика с коротким ходом газового поршня и запирание поротом затвора. Ствольная коробка фрезерованная из стали, со съемной штампованной крышкой. Питание патронами — из отъемных коробчатых магазинов емкостью 5 патронов с размещением патронов в один ряд в корпусе от магазина для СВД. На стволе установлен щелевой пламегаситель. Штатные прицельные приспособления — механические регулируемые, по типу СВД. Слева на ствольной коробке имеется боковая планка для установки кронштейна под оптический прицел.

 


Видео ружья TG3 от Калашников.медиа

 

Характеристика Значение
Используемый патрон 9.6/53 Ланкастер
Тип автоматики самозарядное
Тип УСМ sa
Длина, мм 1100 или 1120
Длина со сложенным прикладом, мм — / 860
Длина ствола, мм 620
Вес без патронов, кг 3. 9 — 4.1
Емкость магазина, патронов 5

 

Приклад для СВД/Тигр/TG3

Ассортимент комплектов модернизаций для карабинов Тигр, TG3 и снайперских винтовок СВД включает в себя ряд изделий для замены штатного приклада.

Приклад в сборе UASSVD. В комплекте поставки муфта, пистолетная рукоять управления огнём, узел складывания (складное колено), приклад со встроенным выдвижным упором щеки. Упор щеки в сложенном положении утапливается заподлицо и не выступает ни вверх, ни в стороны. Приклад оснащён двумя точками крепления быстросъёмных антабок и точкой крепления ремня по бесшумному петлевому способу.

Приклад M4SVD. В комплекте поставки муфта, пистолетная рукоять управления огнём, узел складывания (складное колено), телескопическая труба. В подавляющем большинстве случаев приклад для этого комплекта поставляется отдельно, что позволяет пользователю выбрать и заказать тот приклад, который будет удобен именно ему именно под его задачи.

Приклад M4SVDSB. Комплект поставки полностью аналогичен предыдущему за исключением буферной трубы: она выполнена в виде необслуживаемого пружинного амортизатора отдачи.

Весь ряд полностью и без доработок совместим со снайперскими винтовками Драгунова, карабинами «Тигр» и «TG3», за исключением винтовок СВДС, СВДК и гражданских карабинов на их базе. Изделия не подходят для установки на складные карабины и винтовки ввиду кардинально различающихся узлов крепления прикладов.

Для замены приклада на винтовке СВД или карабине «Тигр» необходимо выполнить неполную разборку в объёме ствольной коробки. Снимать ударно-спусковой механизм, накладки цевья или толкатель нет необходимости.

В комплект поставки каждого приклада входит два винта: один с накатной полукруглой головкой и один с головкой под потай. Первый предназначен для установки на заднее посадочное место, второй – на переднее.

При установке вне условий мастерской настоятельно рекомендуется использовать синий или зелёный фиксатор резьбы для предотвращения самопроизвольного откручивания винтов при стрельбе.

Необходимо следить, чтобы винты входили строго по резьбе, особенно передний, устанавливаемый под углом. Перекос хотя бы на один виток приведёт сначала к срезанию упорных граней на шестигранном углублении винта, а при приложении специнструмента – к облому тела винта.

Наибольшим удобством будет отличаться схема установки, при которой перед началом работ будет снята пистолетная рукоятка управления огнём. При попытке установить изделие в сборе торец рукоятки будет упираться в спусковую скобу, и отверстия под винты в муфте и ствольной коробке не совпадут.

Итоговая схема выглядит следующим образом.

Выполнить неполную разборку карабина.

Отсоединить рукоять управления огнём.

Установить и затянуть задний винт с накатной головкой, предварительно нанеся на резьбу фиксатор.

Установить и затянуть передний винт с потаем, предварительно нанеся на резьбу фиксатор.

Установить рукоятку управления огнём.

При необходимости, изменить направление складывания приклада путём выбивания пальца из трубы. После этого необходимо отсоединить трубу, открутить узел складывания, переориентировать его в противоположную сторону, затянуть винт и установить трубу.

При сборке убедиться, что винты затянуты на требуемое усилие и положение, подвижные части карабина (винтовки) не упираются в них. 

Гладкоствольный карабин TG 3. Гладкоствольный карабин TG3. Гладкоствольный карабин TG3

Очередная новинка российского концерна «Калашников» представленная выставка спальный карабин TG3 в Калли . Модель создана на базе легендарной снайперской винтовки Драгунова и является модификацией уже знакомой охотникам Караборн «Тигр». В чем отличия новинок?

Главной особенностью TG3 является овально-винтовая течь Lancaster () .В зависимости от модели оружия их может быть от двух долек (TG3) до восьми. Ланкастерская выточка позволяет улучшить дальность, точность и кучность стрельбы, в то время как по российским законам оружие по-прежнему считается радным.

Новый карабин предназначен для стрельбы — они значительно крупнее классических 7,62-миллиметровых патронов для «тигров» и СВД, из-за большего калибра в новом карабине ТГ3 ствол несколько утолщен. В TG3 используется

однорядная емкость для приготовления 5 картриджей .

Общая длина оружия 1225 мм, длина ствола 620 мм, масса вместе с заряженным магазином — 3,9 кг. Карабин будет доступен как в деревянном, так и в пластиковом исполнении — первые модели будут выпускаться в «дереве», затем в продажу поступит пластик.

TG3 для охотников

Эта модель «Калашникова» — очередная попытка российских оружейников «донести» закон об оружии. Новый карабин будет доступен по охотничьей гладкоствольной лицензии, потому что формально ствол с нарезкой Ланкастера не считается фиг.Таким образом, новинка должна стать аналогом стрелкового оружия для всех, кто не хочет ждать пять лет для получения лицензии на стрелковое оружие.

Безусловно, новый «Тигр» в первую очередь заинтересует российских охотников — как доступная альтернатива удилищным карабинам. А по заявлению производителей, по точности и адгезии стрельбы на дистанции сто метров новинка почти не уступает оригинальной армейской СВД, но все же калибр 9.6×53 Lancaster отличается не очень хорошей трассой слежения . пуля и снижение траектории на 200м будет около 20см, а на 300м уже около метра.По свидетельству очевидцев, на выставке «Армия-2018» При испытательных стрельбах из Caraborn TG3 с оптическим прицелом можно было вести прицельную стрельбу на дистанции до 300 метров. Из этого следует, что при стрельбе из данного вида оружия необходимо четко знать дистанцию ​​стрельбы, чтобы при стрельбе вносить правильные поправки.

Насколько это применимо к серийным моделям, неизвестно. Кучность, кучность и дальность во многом будут зависеть от качества патронов и самого оружия — остается надеяться, что в серийном производстве у модели не возникнет проблем с качеством сборки.Однако помимо открытых прицельных приспособлений (полетного и летящего) «Карабарин» будет использовать установку оптического прицела. Итак, создатели предлагают охоту на дальние и средние дистанции.

На данный момент пистолет только готовится к серийному производству. Официальных объявлений о начале продаж не было, но на стенде Калашникова обещали выпустить новинку в продажу до конца 2018 года. О цене карабина имеются противоречивые сведения, в основном все ориентируются на стоимость нарезного оружия. охотничьи модели на базе СВД – от 60 до 100 тысяч рублей.В обсуждениях чаще всего называют сумму в 80 000 рублей, но официальной информации от производителя пока не поступало.

Технические характеристики пистолета TG3:

Калибр

9. 6/53 Ланкастер

Тип автоматики

полуавтомат

Длина (мм)

1100 или 1120.

Длина со сложенным прикладом (мм)

Длина штока (мм)

Вес без патронов (кг)

Емкость магазина (ПК)

Преимущества:

  • — Возможность покупки лицензии на гладкоствольное оружие
  • — высокая скорость полета пули (около 700м/с) и большая навозная энергия (около 4000Дж)
  • — Уверенная стрельба на дистанции 100м.
  • — Возможность установки различных оптических прицелов

Недостатки пистолета TG3:

  • — Хорификация патрона 9.6/53 Ланкастер, как раз один производитель этих патронов (технический).
  • — Конструкция винтовки ТГ3 существенно изменена по сравнению с Базовой моделью СВД, что неминуемо отразится на ее надежности.
  • — Плохая траектория полета полифиша.
  • — Большой вес пистолета, не менее 3.9 кг без оптического прицела.

Вы можете подобрать автоматические карабины производителей и поставщиков товаров для охоты.

Материал подготовил Петр Сенин

TG3 Карабин Parax. 01 Soft Landlock 9,6×53 Lancaster L = 620.

Карабин TG3. — Самозарядный гладкоствольный карабин, разработанный на базе знаменитой снайперской винтовки СВД, предназначенный для охоты и учебной стрельбы.

Особенности:

  • карабаб Калашникова. Предназначен для патрона 9,6х53; Съемный магазин вмещает 5 патронов;
  • Калашников ТГ3. отличает оснащение стволом со сверлом Lancaster ; Длина стебля 62 см; Стволовой канал и патрон хромированы с целью увеличения их ресурса; Ствол установлен щелевой глянцевой;
  • Карабин Калашникова Оснащен механическими прицельными приспособлениями открытого типа, состоящими из мушки и планки;
  • — в этом исполнении карабин Калашникова TG3. оснащен пластиковыми попом и прикладом.
Как купить Карабин Калашникова TG3 9,6×53 Lancaster исп.01?

Внимание! Лицензионные товары недоступны для покупки через интернет-магазин.. Квалифицированный персонал даст полную консультацию по товару, уходу за ним и ответит на все интересующие вопросы.
Обратите внимание, что для приобретения огнестрельного оружия и патронов необходимо предоставить лицензия! Ознакомиться с правилами и порядком получения вы можете в разделе

НОВОЕ ЗА НОВОЕ!

Карабин гладкоствольный разработан на базе самозарядной винтовки Драгунова СВД, модификации всем знакомого охотничьего карабина Тигр.

Гладкоствольные карабины TG3 обязательно заинтересуют охотников.
Применяемый патрон 9,6х53 Lancaster в отсеке с особенностями ствола обеспечивают уверенную стрельбу на дистанции до 100 м. Карабин
TG3 оснащен гладким холоднокатаным стволом со сверлом [ Lancaster — Специфика сверла ствола. Профиль канала по форме напоминает в разрезе овал, причем овал закручивается по всей длине ствола. При таких своеобразных нарезах пуля стабилизируется за счет вращения.В результате отличная кучность, кучность и острота боя, аналогичная рубке. Ланкастер]. Профиль канала по форме напоминает в разрезе овал, причем овал закручивается по всей длине ствола. При таких своеобразных нарезах пуля стабилизируется за счет вращения. В результате отличная кучность, кучность и резкость боя, аналогичная рубке.

Приятный плюс — приобрести данный карабин может любой гражданин с лицензией на гладкоствольное оружие, не имеющий пятилетнего стажа.

Применяемые боеприпасы демонстрируют отличные винтовочные характеристики. Скорость полета пули достигает около 700 м/с, энергия охлаждения около 4000 Дж.

Энергия пули выше, чем у 7,62x54r *

* При использовании патрона штатного изготовления ТЭБРИМ


Охотничий карабин будет быть представлен в трех вариантах:
Первое исполнение — с деревянной рамкой приклада и цевьем, съемной щекой на прикладе
Второе — в пластике. Пластиковая рамка приклада и цевьера.
Третий (в перспективе) — будет иметь складной передний металлический приклад по типу винтовки СВДС и пластиковый Цевьер.

Скоро в продаже — новая модель самозарядного карабина Калашникова во всех магазинах

Концерн «Калашников» представил новый карабин TG3, выполненный в дизайне легендарной снайперской винтовки Драгунова (СВД). Масса карабина с заряженным магазином — 3,9 кг. TG3 использует патрон 9,6/53 Lancaster. Магазин — на 5 патронов.На боковой кронштейн можно установить оптический прицел. Приклад выполнен из фанеры со съемной щекой. Общая длина — 1225 мм. Длина ствола — 620 мм.

На боковой кронштейн можно установить оптический прицел, а приклад со съемной щекой выполнен из фанеры.

К оружию применяется патрон 9,6/53 Lancaster, в магазине помещается 5 патронов.

TG3 для охотников.

Эта модель «Калашникова» — очередная попытка российских оружейников «донести» закон об оружии.Новый карабин будет доступен по охотничьей гладкоствольной лицензии, потому что формально ствол с нарезкой Ланкастера не считается фиг. Таким образом, новинка должна стать аналогом стрелкового оружия для всех, кто не хочет ждать пять лет для получения лицензии на стрелковое оружие.

Как отмечает ресурс «Калашников-Медиа», ствол канала Караборн имеет буровой тип «Ланкастер», с таким типом канала в России относится к гладкоствольным. Именно специальное сверление ствола «ЛанКастер» делает Карабин гладкоствольным по нормам современного российского законодательства.

На данный момент пистолет только готовится к серийному производству. Официальных объявлений о начале продаж не было, но на стенде «Калашникова» обещали выпустить новинку в продажу до конца 2018 года.

Преимущества:

  • Возможность покупки лицензии на гладкоствольное оружие
  • Высокая скорость полета шкива (около 700м/с) и большая навозная энергия (около 4000Дж)
  • Уверенная стрельба на дистанции 100м.
  • Возможность установки различных оптических прицелов

Недостатки пистолета TG3:

  • Dorganiza Cartridge 9.6/53 Lancaster Cartridge 9.6×53 Lancaster SP 18 — цена 41 руб, всего один производитель этих патронов (технический).
  • Существенно изменена конструкция винтовки ТГ3 по сравнению с Базовой моделью СВД, что неминуемо отразится на ее надежности.
  • Неверная траектория полета пула.
  • Большой вес ружья, не менее 3.9 кг без оптического прицела.

См. сложные гладкоствольные карабины TG3. можно будет на ближайшей выставке Оружие 2018 (Arms & Hunting 2018), которая пройдет в Москве в гостиной с 11 по 14 октября 2018 года.

В ближайшее время в серийное производство будут запущены карабины TG3.

Константин Кузнецов : СВД ВС ТГ-3.

Стрелок с большим огнетушителем на СВД находился на основании приказа на тренировке с документами и наблюдающими за ним сотрудниками.Это было последовательно задокументировано заранее со всеми. Поэтому можете не злорадствовать недоброжелателей)) У нас точно точно))

TG3 Carabiner 9,6×53 Lancaster L = 620

Концерн Калашников представил свою очередную новинку — самозарядный карабин TG3 Калашникова , созданный на базе легендарной винтовки Драгунова 0 СВ 4Д 9090 3 .
Карабин TG3 Предназначен для ведения охоты и учебной стрельбы.

Характеристики Калашникова TG3:

  • — для стрельбы из пушки, 9.используются патроны калибра 6х53;
  • — буровой ствол Lancaster Позволяет значительно повысить точность и дальность стрельбы;
  • — Канал ствола и патрон хромированные;
  • — на ствол ружья TG3. Установлен щелевой клей;
  • — на винтовочной планке Автомат Калашникова Маркировка аналогична боевому оружию
  • — Пистолет Калашникова TG3. Оснащены открытыми целеуказателями — целиком и летать.
Как купить карабины TG3 9,6×53 Lancaster?

Внимание! Лицензионные товары недоступны для покупки через интернет-магазин.. Квалифицированный персонал даст полную консультацию по товару, уходу за ним и ответит на все интересующие вопросы.
Обратите внимание, что для приобретения огнестрельного оружия и патронов необходимо предоставить лицензия! Ознакомиться с правилами и порядком получения вы можете в разделе

Bi-Cross-Validation SVD и неотрицательная матричная факторизация на JSTOR

Абстрактный

В этой статье представлена ​​форма двойной перекрестной проверки (BCV) для выбора ранга в моделях внешнего произведения, особенно разложения по сингулярным числам (SVD) и неотрицательной матричной факторизации (NMF).Вместо того, чтобы исключить набор строк матрицы данных, мы исключаем набор строк и набор столбцов, а затем предсказываем оставшиеся элементы с помощью операций низкого ранга над оставшимися данными. Мы доказываем самосогласованный результат, выражающий ошибку предсказания как невязку от низкоранговой аппроксимации. Теория случайных матриц и некоторые эмпирические результаты показывают, что меньшие запаздывающие наборы приводят к большему переоснащению, в то время как большие более склонны к недостаточному подбору. В смоделированных примерах мы обнаруживаем, что метод, исключающий половину строк и половину столбцов, работает хорошо.

Информация о журнале

Статистические исследования охватывают огромный диапазон от прямого сотрудничества в предметной области до чистой математической теории. «Анналы прикладной статистики» (AOAS) предназначены для статей прикладной половины этого диапазона. Наша цель — предоставить своевременный и унифицированный форум для всех областей прикладной статистики. AOAS публикуется ежеквартально в печатной и электронной форме Институтом математической статистики.

Информация об издателе

Цель Института математической статистики (ИМС) состоит в том, чтобы способствовать разработка и распространение теории и приложений статистики и вероятность.Институт был образован на собрании заинтересованных лиц 12 сентября 1935 года в Анн-Арборе, штат Мичиган, вследствие чувства что теория статистики будет развита путем образования организации тех, кто особенно интересуется математическими аспектами предмета. Анналы статистики и Анналы вероятностей (которые заменяют «Анналы математической статистики»), Statistical Наука и Анналы прикладной теории вероятностей являются научным журналы института.Они и Бюллетень IMS включают официальные журналы Института. Институт имеет индивидуальное членство и организационное членство. Взносы оплачиваются ежегодно и включают подписку на информационный бюллетень организации, Бюллетень IMS. Члены также получают приоритетное ценообразование на все другие публикации IMS.

Записей с тегом «карабин TG3». Гладкоствольный карабин TG3 Tg 3 дробовик калибра 9.6 53 Lancaster

Карабин TG3 9.6×53 Lancaster L = 620

Концерн Калашников представил свою очередную новинку — самозарядную винтовку TG3 Калашникова , созданную на базе легендарной винтовки Драгунова ( СВД ).
Карабин TG3 предназначен для охоты и учебной стрельбы.

Характеристики автомата Калашникова TG3:

  • — для стрельбы из ружья используются патроны калибра 9,6х53;
  • — сверление ствола Lancaster позволяет значительно повысить точность и дальность стрельбы;
  • — канал ствола и патронник хромированные;
  • — на стволе пушки ТГ3 установлен пламегаситель щелевой;
  • — на оружейной планке автомат Калашникова с маркировкой аналогично боевому оружию
  • — пистолет Калашникова TG3 с открытым прицелом — целиком и мушкой.
Как купить карабин TG3 9.6×53 Lancaster?

Предупреждаем! Лицензионные товары недоступны для покупки через интернет-магазин.. Квалифицированный персонал даст полную консультацию по товару, уходу за ним и ответит на все интересующие вопросы.
Обратите внимание, что для приобретения огнестрельного оружия и патронов необходимо предоставить лицензию! С правилами и порядком получения вы можете ознакомиться в разделе

Концерн «Калашников» представил новый карабин ТГ3, выполненный в конструкции легендарной снайперской винтовки Драгунова (СВД).Масса карабина со снаряженным магазином 3,9 кг. В TG3 используется патрон LANCASTER 9,6/53. Магазин — 5 патронов. На боковой кронштейн можно установить оптический прицел. Приклад изготовлен из фанеры со съемной щекой. Общая длина 1225 мм. Длина ствола – 620 мм.

На боковой кронштейн можно установить оптический прицел, а приклад со съемной щекой выполнен из фанеры.

Оружие использует патрон 9,6/53 Lancaster, магазин вмещает 5 патронов.

TG3 для охотников.

Эта модель Калашникова – очередная попытка российских оружейников перехитрить закон об оружии. Новый карабин можно приобрести по гладкоствольной охотничьей лицензии, потому что технически нарезной ствол Lancaster нарезным не считается. Таким образом, новинка должна стать аналогом нарезного оружия для всех, кто не хочет ждать пять лет для получения лицензии на винтовку.

Как отмечает ресурс «Калашников-медиа», канал ствола карабина имеет «ланкастерский» тип сверления, с таким типом канала ствола в России он относится к гладкоствольным.Именно специальный канал ствола LANCASTER делает винтовку гладкоствольной по нормам современного российского законодательства.

На данный момент пистолет только готовится к серийному производству. Официальных объявлений о начале продаж пока не было, но на стенде «Калашникова» пообещали выпустить новинку в продажу к концу 2018 года.

Преимущества:

  • Возможность покупки по лицензии на гладкоствольное оружие
  • Высокая скорость пули (около 700м/с) и большая дульная энергия (около 4000Дж)
  • Уверенная стрельба на дистанции 100м.
  • Возможность установки различных оптических прицелов

Недостатки пистолета TG3:

  • Дороговизна патрона 9,6/53 Lancaster Патрон 9,6х53 Lancaster SP 18 — цена 41 рубль, только один производитель этих патронов (Техкрим).
  • Конструкция винтовки ТГ3 существенно изменена по сравнению с базовой моделью СВД, что неминуемо отразится на ее надежности.
  • Плохая настильность траектории пули.
  • Большой вес пистолета, не менее 3,9 кг без оптического прицела.

Увидеть воочию Гладкоствольный карабин TG3 будет доступен на следующей выставке Оружие 2018 (Arms & Hunting 2018), которая пройдет в Москве в Гостином дворе с 11 по 14 октября 2018 года.

В ближайшее время карабин TG3 будет запущен в серийное производство.

Константин Кузнецов : СВД ВС ТГ-3.

Стрелок с большим огнетушителем в СВД находился на основании приказа на тренировке с документами и курирующим его составом.Все было задокументировано заранее со всеми. так что можете не злорадствовать недоброжелатели)) у нас все ровно))

Завершившаяся в Москве выставка «Оружие и охота 2018» как-то не произвела впечатления в плане новинок, особенно в чисто охотничьем сегменте. Исключение составляли всевозможные «послепожарные тактические» образцы, вроде вариаций на тему «Винторез» от ТОЗ, а также целая гамма изделий под остропопулярные боеприпасы. 366ТКМ и 9,6х53.Сегодняшний рассказ именно о них, особенно о последних.

Чем обусловлена ​​популярность «парадоксов» .366ТКМ и «Ланкастеров»

В чем прелесть таких устройств? В первую очередь и главным образом в отсутствии необходимости взращивать пока что пятилетний «гладкоствольный» опыт для получения разрешения на их приобретение. И в то же время они чисто визуально не отличаются от классических нарезных собратьев, а по ТТХ находятся между ними и обычными ружьями.

Попытки как-то легально обойти действующее оружейное законодательство, не дожидаясь его либерализации, предпринимаются, кстати, не только в нашей стране. В России чуть ли не первой ласточкой стал ВПО-208 на базе СКС как раз под новый боеприпас .366ТКМ, разработанный на базе патрона 7,62х39 ЗАО «Техкрим» (см.).

А в США, где дробовики и карабины имеют ограничение по минимальной длине, было создано нечто под названием «Franklin Armory Reformation» с прямым (!) нарезом и оперенной пулей.А производитель обошел квалификацию на полноценный автомобиль, внедрив «Binary Fire System», или «Double Fire System». Проще говоря, это триггер, у которого спуск происходит как при нажатии крючка, так и при его отпускании. Эта уникальная разработка описана в статье «. Нам бы их забот…

Техкрим производит патроны .366ТКМ двух типов — дробовые и пулевые, а также несколько типов последних, в том числе полуснаряды СП и снаряды FMJ.

Патроны охотничьи калибра 366 ТКМ с полуоболочечной пулей СП 13:

  • Масса пули, г — 12.6
  • начальная скорость, м/с (для ВПО-208) — 620

Патроны калибра 366 ТКМ с пулей в латунной оболочке FMJ:

  • Масса пули, г — 14
  • диаметр рассеивания (х=100 м), мм — 65

Патроны охотничьи калибра 366 ТКМ со свинцовой пулей в полимерном покрытии Дары:

  • Масса пули, г — 13,5
  • начальная скорость, м/с (для ВПО-208) — 550
  • Диаметр рассеивания (х = 100 м), мм — 75

Патроны ружейные, калибр 366 ТКМ, охотничьи (выстрел № 10):

  • Число (диаметр, мм) дробь — 10 (1.75)
  • Масса выстрела, г — 6,2
  • начальная скорость, м/с (для ВПО-208) — 600

То есть энергия боеприпаса, как и следовало ожидать, заметно различается в зависимости от типа: у FMJ она составляет 2500 Дж, у Дарья — 2000, а у дробового патрона — 1100 Дж.

Не думайте, что «366-й парадокс» и «Ланкастер» вызывают такой восторг только у новичков, не имеющих необходимого опыта владения гладкостволом. Знаю одного коллегу, который впервые купил такой «парадокс».366ТКМ к уже имеющимся полноценным карабинам, и совсем недавно стал обладателем интересного образца TG3 практически из первой промышленной партии, о котором пойдет речь в заключительной главе.

9.6/53 Ланкастер – что это за зверь?

И все же 366ТКМ, по мнению автора, видится больше как спортивный калибр, и не так интересен, как его собрат, о чем, собственно, и пойдет речь ниже в статье. Во-первых, сверление «парадокс» известно давно и применяется в обычных ружьях, в том числе и с помощью дульных насадок.Во вторых довольно «горячая» пуля по сравнению с гладкоствольной вынуждена на полном газу врезаться в нарезы расположенные ближе к дульному срезу, что не кайф…

Предположительно, ЗАО «Техкрим» прекрасно понимало эти нюансы своего детища и совсем недавно создало куда более серьезный боеприпас 9,6х53 «Ланкастер» на базе патрона 7,62х54R. Теперь это другая песня!

Итак, вот данные от самого производителя:

  • Масса пули, г — 14.8
  • начальная скорость, м/с — 750
  • энергия, Дж — 4160
  • диаметр рассеивания (х=100 м), мм — 60

Неслучайно в свое время, когда начались гонения на гражданское нарезное оружие, образцы с ланкастеровской сверловкой попали с ними в одну компанию, в отличие от «парадоксов». И в СССР их было всего пару штук, но нет, товарищи в погонах не видели особой разницы между настоящими карабинами и «Ланкастерами».Это уже говорит о многом. Кстати, незабвенный Александр Хинштейн, ныне «руководитель рабочей группы по анализу и совершенствованию законодательства в сфере частных охранных организаций и контроля за оборотом оружия», в марте 2019 года снова предложил приравнять Ланкастера к нарезное огнестрельное оружие. История повторяется?

Тем, кто еще не встречался с этими нетривиальными образцами, предлагаю посмотреть видео, где все рассказано и показано. Добавлю только, что столкнувшись с ними в первый раз, испытываешь некоторые сомнения — а не заводской ли брак перед тобой, с овальным каналом ствола?

Дополнение, октябрь 2019 г.

Буровое оружие
Lancaster: что, где, когда и стоит ли покупать?

Новый Ланкастер 9.6/53 от Хаммер АРМЗ

Вятско-Полянское Молот ООО АРМЗ, можно сказать, захватило рынок отечественных моделей под 366ТКМ. Как обычно, они создавались на базе забортных армейских моделей — СКС, «мосинки» и, конечно же, «Калаша». На фото современный «АКС-366-Ланкастер-06»:

А вообще, хотя это очень субъективно, такие «Калашоиды» под такие боеприпасы как-то не очень охотничьи.Ну а по мнению «традиционалистов», можно даже сказать — «Кузьмичей», как их любят называть в стрелковых интернет-сообществах. Все-таки они ближе к практической стрельбе или что-то в этом роде (да простят меня владельцы классической «Сайги», успешно ловящие из нее зверя!). Судя по всему, это понимает и Хаммер АРМЗ.

Боеприпас 9,6/53 превосходит 366ТКМ (~9,6х38) по энергетике почти в два раза, скоростные показатели, а соответственно настильность траектории тоже заметно лучше.Они уже гораздо ближе к своим действительно охотничьим собратьям, например, 9х53R, который в советское время был единственным отечественным крупнокалиберным патроном, использовавшимся в достаточно редких карабинах «Медведь», «Лось» и некоторых штуцерах.

В производственной линейке «Техкрим» также имеются патроны 9,6/53 с «уменьшенной скоростью» (версия США). Они предназначены «для охоты на мелких животных массой до 100 кг».

А это новинка 2019 года, экспансивный патрон 9,6/53 Lancaster с полуоболочечной пулей Kion 18.Судя по всему, очень смертоносная штуковина.

По аналогии с дробовиками. 366ТКМ, в мае 2019 года в линейке Техкрима появилась картечь 9,6/53 (на фото ниже). Область их применения, если честно, для меня остается загадкой. Все-таки количество картечи-восьмерки здесь почти в два с половиной раза меньше, чем в патроне 12К.

Еще на выставке «Охота и оружие 2017» компания «Молот-Оружие» представила «Гладкоствольный карабин «Егерь» (ВПО-223) под 9.6 / 53.

Создан на базе классического болтового карабина ВПО-114. Ну и глаза прямо вперед так и хочется взять их в руки! Уже тогда часть ВПО-223 возили в эргономичном ламинатном ложе от фирмы Арт Деко:

Кстати, на выставке «Оружие и охота 2018» компания также представила целое семейство легких и универсальных карабинов с компактной ствольной коробкой «Горностай» (фото ниже), предназначенных в основном для «промежуточных» калибров.223 Rem, 7,62х39, «Грендель», а также 366ТКМ.

«Егеря» изначально создавались для более солидной винтовки. 308Win, 7.62x54R, и, как видите, мощнее 366-го, 9.6/53 Lancaster (хотя уже есть ряд крайне странных случаев взрыва Экстра НПЗ находится на ВПО-111 — вот что Молот и В настоящее время занимаются новосибирцы). Правда сейчас они идут под маркой «Таежник», что связано с вопросами собственности, брендов и т.д.Для нас, практиков, по большому счету это не имеет значения, но информация во избежание путаницы не помешает, правда? Итак, все «Таежники» будут выпускаться как в классических коробках, так и в «тактических» версиях, в том числе камуфляжных.

В общем, никто не уйдет обиженным — ни «тактики», ни «Кузьмичи» :)).

Однако буквально на глазах у продукции «Хаммер АРМЗ» появился очень серьезный конкурент. Именно он приобрел вышеназванного товарища.Речь идет о карабине TG3.

Гладкоствольный карабин ТГ3 — «СВД для начинающих»

К сожалению, Концерн Калашников практически демонстративно отказался от участия в выставке «Оружие и охота 2018». И интересно было бы сравнить степень интереса к Ланкастерам из Вятских Полян и их прямому конкуренту — ижевскому карабину TG3.

Ни на что не похоже? Ну конечно же это Великая и Ужасная «Плеть», она же СВД! Ну ладно, ее гражданская форма — охотничий карабин «Тигр».Как оружие с такой харизмой может стать популярным!?

В 2017 году Концерн представил общественности свою новую разработку — созданную на базе гладкоствольного карабина АК-103 TG2 :

И все бы ничего, но облик «Сайги», появившейся еще в советское время, стал привычным в массовом гражданском обороте еще с 90-х годов. К тому же есть и его гладкоствольные варианты, и 410-й калибр, практически аналогичный по характеристикам 366ТКМ, и насадка «парадокс» совсем другая…Опять же уже существовали аналоги от «Молота» созданного на базе «Калаша» того же ВПО-209.

А вот решение о разработке TG3 можно назвать беспроигрышным ходом. Ну посудите сами, кого мы можем представить с конверсионным АК в руках? Правильно, пехотинцем, которым почему-то никто быть не хочет. А с огражденной СВД? Естественно — снайпер! И, заметьте, это без всякого опыта. Кто может сопротивляться этому?

Более того, полноценный нарезной прототип ТГ3 — карабин «Тигр» (так же, как и тяжелый, но гораздо более дешевый и простой «Вепрь») — можно встретить в самых суровых местах среди профессиональных охотников, то есть машины действительно рабочие.Кроме того, TG3 наверняка изначально проектировался для стрельбы мощными штатными боеприпасами 9,6/53, а не их ослабленными американскими модификациями (см. предыдущие главы этой статьи).

QC также выпустил полимерную версию TG3. Так выглядит сегодняшняя СВД, а также охотничий карабин Тигр 7,62Х54R исп. 01.

Помимо различий в сверлении и калибре, TG3 имеет еще одно существенное отличие от своего полноценного нарезного прототипа. И вызвано это как раз гораздо более широкой доступностью «Ланкастеров», а значит, и кругом потенциальных покупателей.Если стоимость «Тигра» около 50 тысяч рублей, то в случае с TG3 речь идет о 85 (!) тысячах (в деревянном ящике, в пластиковом — около 60 т.р.). Это не только плата за вышеперечисленные преимущества, но и за внедрение новых технологий. Ведь если обычные стволы производились десятилетиями, то разработка 9,6/53 потребовала дополнительных вложений в разработку и производство. Есть надежда, что со временем цена немного упадет, если не вмешаются внешние, далекие от рынка факторы.

Но вернемся к герою нашего рассказа. Итак, основные характеристики гладкоствольного карабина TG3:

  • tG3 длина — 1225 мм при длине ствола 620 мм
  • общая масса карабина со снаряженным магазином — 3,9 кг
  • Емкость магазина
  • – 5 патронов.

Карабин TG3 против СВД и «Тигра» (видео)

Буквально с момента появления первой информации о «гладкоствольном карабине» TG3 под 9.6/53, Ланкастер очень хотел, чтобы кто-то из владельцев новинки провел сравнительную стрельбу его и некоего прототипа — охотничьего карабина «Тигр» 7,62х54R.

Пока нигде не найден, но энтузиасты ORENGUN пошли еще дальше. За отправную точку был выбран прототип самого Тигра — СВД, то есть «бабушка» ТГ3 :)). Что ж, посмотрим, на что способна новорожденная внучка. И начинаем копить деньги…

С.С. Волей-неволей мы тоже потихоньку привыкаем к совершенно несуразным оружейно-языковым нововведениям типа «гладкоствольного карабина». Все-таки, если отбросить буквально разрозненные исторические факты, карабин — это облегченная винтовка (то есть нарезное оружие) с укороченным стволом. Кстати, классический «Тигр» тоже «карабин», со стволом 620 мм!

Добавляем 2019.

Ну вот мы и дождались видео о сравнительной съемке TG3 и Тигра.Смотрим:

Очередная новинка российского концерна Калашников представленный на выставке гладкоствольный карабин ТГ3 калибра … Модель создана на базе легендарной снайперской винтовки Драгунова и представляет собой модификацию уже знакомого охотникам карабина Тигр. В чем отличия новинок?

Главной особенностью TG3 является овальный винт Lancaster () … В зависимости от модели оружия нарезов может быть от двух (ТГ3) до восьми.Сверление Ланкастера позволяет улучшить дальность, точность и кучность стрельбы, при этом по российским законам оружие по-прежнему считается гладкоствольным.

Новый карабин предназначен для стрельбы — они значительно крупнее классических патронов 7,62 мм для «Тигров» и СВД, из-за большего калибра в новом карабине ТГ3 ствол несколько толще. В TG3 используется однорядный отъемный магазин емкостью 5 патронов .

Общая длина оружия 1225 мм, длина ствола 620 мм, вес со снаряженным магазином 3.9 кг. Карабин будет доступен как в деревянном, так и в пластиковом исполнении — первые модели будут выпускаться в «дереве», затем в продажу поступит и пластик.

TG3 для охотников

Эта модель Калашникова – очередная попытка российских оружейников перехитрить закон об оружии. Новый карабин можно приобрести по гладкоствольной охотничьей лицензии, потому что технически нарезной ствол Lancaster нарезным не считается. Таким образом, новинка должна стать аналогом нарезного оружия для всех, кто не хочет ждать пять лет для получения лицензии на нарезное оружие.

Безусловно, новый «Тигр» в первую очередь заинтересует российских охотников — как доступная альтернатива нарезным карабинам. И по заверениям производителей, по кучности и кучности стрельбы на дистанции до ста метров новинка почти не уступает оригинальной армейской СВД, но все же калибр 9.6×53 Lancaster не очень ровная тректория полет пули и снижение траектории на 200м будет около 20см, а на 300м уже около метра.По свидетельству очевидцев, на выставке «Армия-2018» при испытательных стрельбах из карабина ТГ3 с оптическим прицелом можно было вести прицельный огонь на дистанцию ​​до 300 метров. Из этого следует, что при стрельбе из данного вида оружия необходимо четко знать дистанцию ​​стрельбы, чтобы при стрельбе делать правильные поправки.

Насколько это применимо к серийным моделям, неизвестно. Кучность, кучность и дальность во многом будут зависеть от качества патронов и самого оружия — остается надеяться, что проблем с качеством сборки у модели не будет в серийном производстве.Тем не менее, кроме открытых прицелов (целика и мушки), на карабин будет доступна установка оптического прицела. Это значит, что создатели предполагают охоту на дальние и средние дистанции.

На данный момент пистолет только готовится к серийному производству. Официальных объявлений о начале продаж пока не было, но на стенде Калашникова пообещали выпустить новинку в продажу к концу 2018 года. О цене карабина информация противоречивая, в основном все ориентируются на стоимость нарезных охотничьих моделей на базе СВД — от 60 до 100 тысяч рублей.В обсуждениях чаще всего называют сумму в 80 000 рублей, но официальной информации от производителя пока не поступало.

Технические характеристики пистолета TG3:

Калибр

9,6/53 Ланкастер

Тип автоматики

полуавтомат

Длина (мм)

1100 или 1120

Длина со сложенным прикладом (мм)

Длина ствола (мм)

Вес пустого (кг)

Емкость магазина (шт.)

Преимущества:

  • — Возможность приобретения лицензии на гладкоствольное оружие
  • — Высокая скорость пули (около 700м/с) и высокая дульная энергия (около 4000Дж)
  • — Уверенная стрельба на дистанции 100м.
  • — Возможность установки различных оптических прицелов

Недостатки пистолета TG3:

  • — Высокая стоимость патрона 9.6/53 Lancaster, только у одного производителя этих патронов (Техкрим).
  • — Существенно изменена конструкция винтовки ТГ3 по сравнению с базовой моделью СВД, что неминуемо отразится на ее надежности.
  • — Плохая настильность траектории пули.
  • — Большой вес пистолета, не менее 3.9 кг без оптического прицела.

Вы можете выбрать для себя автоматический карабин у производителей и поставщиков охотничьих товаров.

Материал подготовил Петр Сенин

MPEG Видео водяные знаки с использованием тензорной сингулярной декомпозиции

‘) переменная голова = документ.getElementsByTagName(«голова»)[0] var script = document.createElement(«сценарий») script.type = «текст/javascript» script.src = «https://buy.springer.com/assets/js/buybox-bundle-52d08dec1e.js» script.id = «ecommerce-scripts-» ​​+ метка времени head.appendChild (скрипт) var buybox = document.querySelector(«[data-id=id_»+ метка времени +»]»).parentNode ;[].slice.call(buybox.querySelectorAll(«.вариант-покупки»)).forEach(initCollapsibles) функция initCollapsibles(подписка, индекс) { var toggle = подписка.querySelector(«.цена-варианта-покупки») подписка.classList.remove(«расширенный») var form = подписка.querySelector(«.форма-варианта-покупки») если (форма) { вар formAction = form.getAttribute(«действие») документ.querySelector(«#ecommerce-scripts-» ​​+ timestamp).addEventListener(«load», bindModal(form, formAction, timestamp, index), false) } var priceInfo = подписка.querySelector(«.Информация о цене») var PurchaseOption = toggle.parentElement если (переключить && форма && priceInfo) { toggle.setAttribute(«роль», «кнопка») toggle.setAttribute(«tabindex», «0») переключать.addEventListener(«щелчок», функция (событие) { var expand = toggle.getAttribute(«aria-expanded») === «true» || ложный toggle.setAttribute(«aria-expanded», !expanded) form.hidden = расширенный если (! расширено) { покупкаOption.classList.add(«расширенный») } еще { покупкаOption.classList.удалить («расширить») } priceInfo.hidden = расширенный }, ложный) } } функция bindModal (форма, formAction, метка времени, индекс) { var weHasBrowserSupport = window.fetch && Array.from функция возврата () { var Buybox = EcommScripts ? EcommScripts.Buybox : ноль var Modal = EcommScripts ? EcommScripts.Модальный: ноль if (weHasBrowserSupport && Buybox && Modal) { var modalID = «ecomm-modal_» + метка времени + «_» + индекс var modal = новый модальный (modalID) modal.domEl.addEventListener («закрыть», закрыть) функция закрыть () { form.querySelector(«кнопка[тип=отправить]»).фокус() } вар корзинаURL = «/корзина» var cartModalURL = «/cart?messageOnly=1» форма.установить атрибут ( «действие», formAction.replace(cartURL, cartModalURL) ) var formSubmit = Buybox.interceptFormSubmit( Buybox.fetchFormAction(окно.fetch), Buybox.triggerModalAfterAddToCartSuccess(модальный), функция () { форма.removeEventListener («отправить», formSubmit, false) форма.setAttribute( «действие», formAction.replace(cartModalURL, cartURL) ) форма.отправить() } ) form.addEventListener («отправить», formSubmit, ложь) документ.body.appendChild(modal.domEl) } } } функция initKeyControls() { document.addEventListener («нажатие клавиши», функция (событие) { if (document.activeElement.classList.contains(«цена-варианта-покупки») && (event.code === «Пробел» || event.code === «Enter»)) { если (document.activeElement) { мероприятие.предотвратить по умолчанию () документ.activeElement.click() } } }, ложный) } функция InitialStateOpen() { вар buyboxWidth = buybox.offsetWidth ;[].slice.call(buybox.querySelectorAll(«.опция покупки»)).forEach(функция (опция, индекс) { var toggle = option.querySelector(«.цена-варианта-покупки») вар форма = вариант.querySelector(«.форма-варианта-покупки») var priceInfo = option.querySelector(«.Информация о цене») если (buyboxWidth > 480) { переключить.щелчок() } еще { если (индекс === 0) { переключить.щелчок() } еще { toggle.setAttribute («ария-расширенная», «ложь») форма.скрытый = «скрытый» priceInfo.hidden = «скрытый» } } }) } начальное состояниеОткрыть() если (window.buyboxInitialized) вернуть window.buyboxInitialized = истина initKeyControls() })()

Использование SVD на кластерах для повышения точности измерения сходства между документами

Недавно LSI (латентное семантическое индексирование), основанное на SVD (разложение по единственному значению), было предложено для преодоления проблем многозначности и омонимии в традиционном лексическом сопоставлении.Однако его обычно критикуют за низкую дискриминационную способность для представления документов, хотя было подтверждено, что он обладает хорошим репрезентативным качеством. В этой статье SVD на кластерах предлагается улучшить дискриминационную способность LSI. Вклад этой статьи три многообразия. Во-первых, мы делаем обзор существующих методов линейной алгебры для LSI, включая методы, основанные на SVD, и методы, не основанные на SVD. Во-вторых, мы предлагаем SVD на кластерах для LSI и теоретически объясняем, что расширение размерности векторов документов и проекция размерности с использованием SVD — это две манипуляции, связанные с SVD на кластерах.Более того, мы разрабатываем процессы обновления для сворачивания новых документов и терминов в декомпозированную матрицу методом СВД по кластерам. В-третьих, два корпуса, китайский корпус и английский корпус, используются для оценки эффективности предлагаемых методов. Эксперименты показывают, что SVD на кластерах может в некоторой степени повысить точность измерения сходства между документами по сравнению с другими методами LSI на основе SVD.

1. Введение

По мере того, как компьютерные сети становятся основой науки и экономики, становится доступным огромное количество машиночитаемых документов.Тот факт, что около 80% бизнеса ведется с использованием неструктурированной информации [1, 2], делает большой спрос на эффективные и действенные методы анализа текста, которые направлены на обнаружение высококачественных знаний из неструктурированной информации. К сожалению, обычная парадигма программирования, основанная на логике, имеет большие трудности с улавливанием нечетких и часто неоднозначных отношений в текстовых документах. По этой причине интеллектуальный анализ текста, который также известен как обнаружение знаний из текстов, предлагается для устранения неопределенности и нечеткости языков и выявления скрытых закономерностей (знаний) в документах.

Обычно информация извлекается путем буквального сопоставления терминов в документах с терминами запроса. Однако методы лексического сопоставления могут быть неточными, когда они используются для сопоставления с запросом пользователя. Поскольку обычно есть много способов выразить данное понятие (синонимия), буквальные термины в запросе пользователя могут не совпадать с терминами в соответствующем документе. Кроме того, большинство слов имеют несколько значений (полисемия и омоним), поэтому термины в запросе пользователя будут буквально соответствовать терминам в нерелевантных документах.По этим причинам лучший подход позволил бы пользователям извлекать информацию на основе концептуальной темы или значений документа [3, 4].

Скрытое семантическое индексирование (LSI) предлагается для преодоления проблемы лексического сопоставления путем использования для поиска статистически полученных концептуальных индексов вместо отдельных слов [5, 6]. Мы называем этот метод поиска скрытым семантическим индексированием, потому что подпространство представляет собой важные ассоциативные отношения между терминами и документами, которые не очевидны в отдельных документах.LSI предполагает, что в использовании слов существует некоторая скрытая или скрытая структура, которая частично скрыта вариативностью в выборе слов. Используя разложение по сингулярным числам (SVD), можно воспользоваться неявной структурой высшего порядка в ассоциации терминов с документами, определив SVD большой разреженной матрицы термин-документ. Термины и документы, представленные уменьшенным размером наибольших сингулярных векторов, затем сопоставляются с запросами пользователей. Данные о производительности показывают, что статистически полученная матрица терминов-документов с помощью SVD более надежна для извлечения документов на основе понятий и значений, чем исходная матрица терминов-документов, созданная с использованием только отдельных слов с моделью векторного пространства (VSM).

В этой статье мы предлагаем SVD на кластерах (SVDC) для улучшения дискриминационной способности LSI. Вклад этой статьи три многообразия. Во-первых, мы делаем обзор существующих методов линейной алгебры для LSI, включая методы, основанные на SVD, и методы, не основанные на SVD. Во-вторых, мы теоретически объясняем, что расширение размерности векторов документов и проекция размерности с использованием SVD — это две манипуляции, связанные с SVD на кластерах. Разрабатываем процессы обновления для сворачивания новых документов и терминов в декомпозированную матрицу методом СВД по кластерам.В-третьих, два корпуса, китайский корпус и английский корпус, используются для оценки эффективности предлагаемых методов.

Остальная часть этого документа организована следующим образом. Раздел 2 содержит обзор последних исследований по скрытому семантическому индексированию и связанным с ним темам. Раздел 3 предлагает SVD для кластеров и процесс его обновления. Раздел 4 представляет собой эксперимент по оценке предложенных методов. Раздел 5 завершает этот документ и указывает на будущую работу.

2. Сопутствующая работа
2.1. Разложение по сингулярным числам

Разложение по сингулярным значениям обычно используется при решении неограниченных линейных задач наименьших квадратов, оценке матричного ранга и каноническом корреляционном анализе [7, 8]. Данная матрица , где без ограничения общности и , сингулярное разложение матрицы , обозначаемое , определяется как

Здесь и , при и при . Первые столбцы ортонормированных матриц и определяют ортонормированный собственный вектор, связанный с ненулевыми собственными значениями и соответственно.Столбцы и называются левым и правым сингулярными векторами соответственно, а сингулярные значения определяются как диагональные элементы которых являются неотрицательными квадратными корнями собственных значений . Кроме того, если мы определим , то мы обнаружим, что это наилучшее приближение для с точки зрения нормы Фробениуса [7].

2.2. Недавние исследования в LSI

Недавно для проведения LSI был предложен ряд методов, основанных на различных методах разложения матрицы.Общим моментом этих методов декомпозиции является нахождение матрицы с недостаточным рангом в декомпозированном пространстве для аппроксимации исходной матрицы, чтобы можно было скорректировать частотное искажение терма в терм-документе. По сути, мы можем разделить эти методы на две категории: матричная декомпозиция на основе SVD и матричная декомпозиция без SVD. В таблице 1 перечислены существующие методы линейной алгебры для БИС.

5 R-SVD



Категория Аббревиатура Полное имя

СВД на основе декомпозиции для терм документа матрицы IRR Итерационный Остаточная перемасштабирования
SVR сингулярного перемасштабирования
ADE Приблизительный Размер Уравнивание

Non-СВД на основе разложения для матрицы термин документа SDD Полудискретный распад
LPI Населенный пункт Сохраняя Индексирование

в аспекте методов LSI на основе SVD, он включает в себя IRR [9], SVR [10] и ADE [11 ].Вкратце, IRR предполагает, что SVD удаляет два вида «шумов» из исходной матрицы «термин-документ»: исключительные документы и документы с второстепенными терминами. Однако если мы сосредоточимся на характеристике взаимосвязей документов в коллекции, а не на поиске репрезентативных документов, то IRR может сыграть эффективную роль в этой работе. Основная идея SVR заключается в том, что «шум» в векторах представления исходного документа исходит от второстепенных векторов, то есть тех векторов, которые далеки от репрезентативных векторов с точки зрения расстояния.Таким образом, нам нужно увеличить влияние репрезентативных векторов и одновременно уменьшить влияние второстепенных векторов в матрице аппроксимации. Следуя этой идее, SVR регулирует различия между большими и малыми размерностями в матрице аппроксимации путем масштабирования сингулярных значений в . Основываясь на наблюдении, что сингулярные значения имеют характеристики структуры с низким рангом и сдвигом, ADE пытается сгладить первые наибольшие сингулярные значения с фиксированным значением и объединить с другими малыми сингулярными значениями для реконструкции, чтобы сделать значения измерений относительно выравненными в матрица аппроксимации .

В аспекте методов LSI, не основанных на SVD, он включает SDD [12], LPI [13] и R-SVD [14]. SDD ограничивает значения в сингулярных векторах ( и ) в матрице аппроксимации только наличием элементов в наборе . Таким образом, ему требуется только одна двадцатая памяти и только половина времени запроса, в то время как он может это сделать, а SVD выполняет LSI с точки зрения поиска информации. LPI утверждает, что LSI стремится раскрыть наиболее репрезентативные, а не наиболее отличительные черты для представления документа.С этой целью LPI строит граф смежности документов и стремится обнаружить локальную структуру пространства документа с помощью локальной сохраняющей проекции (LPP). По сути, мы можем считать, что LPI адаптирован из LDA (линейный дискриминантный анализ) [15], который является темой, касающейся уменьшения размерности для контролируемой классификации. R-SVD математически отличается от SVD тем, что матричное разложение SVD по терминам и документам основано на полном наименьшем квадрате (TLS), а матричное разложение в R-SVD основано на структурированном общем наименьшем квадрате (STLS).R-SVD предназначен не для LSI, а для фильтрации информации с целью повышения эффективности поиска информации с использованием отзывов пользователей.

Недавно были представлены два метода в [16, 17], которые также используют SVD и кластеризацию. В [16] Гао и Чжан исследуют три стратегии использования кластеризации и SVD для поиска информации: некластерный поиск, полный кластерный поиск и частичный кластерный поиск. Их исследование показывает, что частичное извлечение кластера обеспечивает наилучшую производительность.В [17] Кастелли и соавт. использовать кластеризацию и разложение по сингулярным числам для поиска ближайшего соседа при индексации изображений. Они используют SVD для поворота исходных векторов изображений для создания некоррелированных признаков с нулевым средним. Кроме того, в их методе также используется стратегия рекурсивной кластеризации и SVD, когда расстояние между реконструированными центроидами и исходными центроидами превышает пороговое значение.

Хотя эти два метода очень похожи на SVD на кластерах, они предлагаются для разных целей с разными целями.Во-первых, это исследование представляет собой полную теорию SVD на кластерах, включая теоретическую мотивацию, теоретический анализ эффективности и процесс обновления, которые полностью не упоминаются ни в одном из двух упомянутых методов. Во-вторых, это исследование описывает подробные процедуры использования SVD на кластерах и попытки использовать различные методы кластеризации (кластеризация -Means и SOM), которые также не упоминаются ни в одном из двух упомянутых методов. В-третьих, мотивы предложения SVDC отличаются от их мотивов.Они предложили кластеризацию и SVD для неоднородных наборов данных, и наша цель — улучшить дискриминационную способность индексации документов.

3. СВД на кластерах
3.1. Мотивация

Мотивация предложения SVD на кластерах может быть определена как следующие 4 аспекта: (1) Огромная вычислительная сложность, связанная с традиционным SVD. Согласно [18], реальная вычислительная сложность SVD квадратична по рангу матрицы термин-документ (ранг ограничен меньшим из числа документов и числа термов) и кубична по числу сингулярных значений, которые вычисляются [19].С одной стороны, в большинстве случаев СВД для матрицы термин-документ количество документов значительно меньше, чем количество терминов-индексов. С другой стороны, количество сингулярных значений, равное рангу матрицы термин-документ, также зависит от количества документов. По этой причине можно считать, что вычислительная сложность СВД полностью определяется количеством документов в матрице термин-документ. То есть, если уменьшить количество документов в матрице термин-документ, то можно уменьшить и огромную вычислительную сложность SVD.(2) Кластеры, существующие в коллекции документов. Обычно в разных документах текстовой коллекции разбросаны разные темы. Даже если все документы в коллекции относятся к одной теме, мы можем разделить их на несколько подтем. Хотя SVD может обнаруживать наиболее репрезентативные векторы для представления текста, он может оказаться неоптимальным при различении документов с различной семантикой. При поиске информации необходимо найти как можно больше релевантных документов с запросом; с другой стороны, нерелевантные документы с запросом должны быть получены как можно меньше.Если основные кластеры, в которых документы имеют тесно связанную семантику, могут быть извлечены автоматически, то релевантные документы могут быть извлечены в кластере с предположением, что тесно связанные документы, как правило, относятся к одному и тому же запросу; то есть релевантные документы больше похожи друг на друга, чем на нерелевантные документы. (3) Контекстная информация и совпадение индексных терминов в документах. Предлагаются классические схемы взвешивания [20, 21] на основе информации о частотном распределении терминов индекса в пределах всей коллекции или в релевантных и нерелевантных наборах документов.Базовая модель для этих схем взвешивания терминов является вероятностной и предполагает, что индексные термины, используемые для представления, распределяются в документах независимо. Предположение о том, что переменные независимы, обычно является вопросом математического удобства. Однако, по характеру информационного поиска, использование зависимости или ассоциации между индексными терминами или документами часто приводит к лучшим результатам поиска, таким как большинство методов линейной алгебры, предложенных для LSI [3, 22]. То есть с математической точки зрения индексные термины в документах зависят друг от друга.С точки зрения лингвистики, тематические слова склонны к взрыву в документах, а лексические слова, относящиеся к одной и той же теме, могут встречаться в одном и том же содержании. То есть контекстуальные слова индексного термина также должны быть выделены и объединены при использовании для поиска. В этом смысле отслеживание совпадения терминов указателя в документах и ​​последующее отслеживание совпадения документов с некоторыми общими терминами указателя имеет большое значение для характеристики взаимосвязей документов в текстовой коллекции.(4) Стратегия «разделяй и властвуй» как теоретическая поддержка. Сингулярные значения в СВД матрицы терминов-документов имеют характеристику малоранговой плюс-сдвиговой структуры; то есть сингулярные значения сначала резко уменьшаются, заметно выравниваются и резко падают в конце. Согласно Жа и соавт. [23], мы знаем, что если имеет структуру низкого ранга плюс сдвиг, то оптимальное приближение низкого ранга может быть вычислено с помощью подхода «разделяй и властвуй». То есть, аппроксимация подматриц может также давать в БИС эффективность, сравнимую с прямой СВД .

Принимая во внимание все вышеизложенные наблюдения как из практики, так и из теоретического анализа, SVD на кластерах предлагается для LSI, чтобы улучшить его дискриминационную способность в этой статье.

3.2. Алгоритмы

Чтобы продолжить, основные концепции, принятые в SVD для кластеров, определены ниже, чтобы прояснить оставшуюся часть этой статьи.

Определение 1 (кластерная подматрица). Предполагая, что это матрица термин-документ, то есть ( является вектором термин-документ), после процесса кластеризации векторы документов разбиваются на непересекающиеся группы (каждый документ принадлежит только к одной группе, но все документы имеют одинаковые термины для представление).Для каждого из этих кластеров можно построить подматрицу путем группировки векторов документов, которые разбиты на один и тот же кластер с помощью алгоритма кластеризации. То есть из-за того, что изменением порядка векторов документов в можно пренебречь. Затем можно назвать, что    является кластерной подматрицей .

Определение 2 (матрица аппроксимации SVDC). Предполагая, что являются всеми кластерными подматрицами , то есть , после SVD для каждой из этих кластерных подматриц, то есть , , и является рангом матрицы аппроксимации SVD и, является матрицей аппроксимации SVD , тогда можно назвать, что является аппроксимационной матрицей SVDC .

С двумя приведенными выше определениями подматрицы кластера и матрицы аппроксимации SVDC мы предложили две версии SVD на кластерах с использованием кластеризации -средних [24] и кластеризации SOM (самоорганизующихся карт) [25]. Эти две версии проиллюстрированы в алгоритмах 3 и 4 соответственно. Отличие этих двух версий заключается в используемых в них разных алгоритмах кластеризации. Для кластеризации -Means нам необходимо предварительно определить количество кластеров в коллекции документов, а для кластеризации SOM нет необходимости предварительно определять количество кластеров.

Алгоритм 3. Алгоритм SVD на кластерах с кластеризацией -Means для аппроксимации матрицы терминов-документов для LSI выглядит следующим образом:  Входные данные:  – матрица терминов-документов; то есть, . предопределенное количество кластеров в . – предопределенный ранг матрицы аппроксимации SVD для подматриц кластеров . Выходные данные:  — матрица аппроксимации SVDC для . Метод: (1) Сгруппируйте векторы документов в кластеры, используя алгоритм кластеризации -Means. (2) Распределите векторы документов в соответствии с метками кластеров векторов для построения подматриц кластера.(3)   Проведите SVD для каждой из кластерных подматриц и создайте их аппроксимационную матрицу SVD, соответственно. То есть .(4) Объединить все матрицы аппроксимации SVD кластерных подматриц, чтобы построить матрицу аппроксимации SVDC для . То есть, .

3.3. Теоретический анализ SVD на кластерах

Для простоты здесь мы рассматриваем только случай, когда термин-документ сгруппирован в две кластерные подматрицы и ; т. е. после обработки СВД для и получаем и .Для удобства объяснения, если предположить, что мы получим, что и ; то есть и являются ортогональными матрицами. Отсюда мы также получим, где общее число элементов в и которые отличны от нуля. Таким образом, мы можем сказать, что это сингулярное разложение и является близким приближением для с точки зрения нормы Фробениуса (при условии, что мы сортируем значения в в порядке убывания и адаптируем порядок и соответственно).

Мы можем сделать вывод, что на самом деле SVD выполняет два вида манипуляций с кластерами: первый — расширение размерности векторов документа, а второй — проекция размерности с использованием SVD.

С одной стороны, обратите внимание, что и , расширился в другое пространство, где число измерений в два раза больше, чем исходное пространство . То есть, в , мы разложили каждый вектор документа в вектор измерения с помощью Здесь, это значение измерения в , это значение измерения , и . Таким образом, мы разложили каждый в вектор размерности, где значения равны соответствующим значениям , если принадлежит кластеру или нулю, если не является членом этого кластера.

Теоретически, согласно объяснению, векторы документов, которые не находятся в одной подматрице кластера, будут иметь нулевое косинусное сходство.Однако на самом деле все векторы документов имеют одни и те же термины в представлении, а расширение размеров векторов документов получается путем простого копирования исходного темпа . По этой причине на практике мы используем векторы в и для индексации, а косинусное сходство векторов документов в и не обязательно будет равно нулю. Это подтверждает нашу мотивацию использования меры подобия для оценки производительности LSI в разделе 4.2.

Алгоритм 4. Алгоритм SVD на кластерах с кластеризацией SOM для аппроксимации матрицы терминов-документов для LSI выглядит следующим образом:  Входные данные:  – матрица терминов-документов; то есть, .предопределенная скорость сохранения для подматриц . Выходные данные:  — матрица аппроксимации SVDC для . Метод: (1) Кластеризовать векторы документов в кластеры с использованием алгоритма кластеризации SOM. (2) Распределить векторы документов в соответствии с метками кластеров векторов из для построения подматриц кластера (обратите внимание, что это не предопределенное количество кластеров, а количество нейронов, совпадающих по крайней мере с 1 вектором документа). (3)  Проведите SVD, используя предопределенную степень сохранения для каждой подматрицы кластера, и создайте свою аппроксимационную матрицу SVD.То есть .(4) Объединить все матрицы аппроксимации SVD кластерных подматриц, чтобы построить матрицу аппроксимации SVDC для . То есть, .

С другой стороны, при использовании SVD для , т. е. , мы получаем и далее говорим, что SVD свернула каждый документ-вектор в сокращенное пространство (при условии, что мы используем для левого умножения , число измерений исходные векторы документов будут сокращены до ), который представлен и отражает латентные семантические измерения, характеризуемые совпадением терминов [3].Точно так же для имеем и далее можно сказать, что проецируется в пространство, которое представлено . Однако здесь характеризуется не совпадением членов , а существующими кластерами и совпадением членов каждой кластерной подматрицы .

3.4. Вычислительная сложность SVD на кластерах

Вычислительная сложность SVDC равна , где максимальное количество документов в и является соответствующей приблизительной кластерной подматрицей . Поскольку исходная матрица терминов-документов разбита на кластерные подматрицы с помощью алгоритма кластеризации, мы можем оценить и .То есть вычислительная сложность SVD по сравнению с SVDC уменьшилась примерно на . Чем больше значение is, то есть чем больше значение кластеров документов для коллекции документов, тем больше сложность вычислений, которую SVD сэкономит на кластерах при матричной факторизации. Хотя можно утверждать, что процесс кластеризации в SVD на кластерах приведет к сложности вычислений, на самом деле стоимость кластерных вычислений намного меньше, чем у SVD.Например, вычислительная сложность кластеризации -Means составляет [24], где и имеют то же значение, что и в SVD на кластерах, а — количество итераций. Вычислительная сложность кластеризации несопоставима со сложностью SVD. Вычислительная сложность кластеризации SOM аналогична кластеризации -Means.

3.5. Обновление SVD на кластерах

В быстро меняющихся средах, таких как Всемирная паутина, коллекция документов часто обновляется, постоянно добавляются новые документы и термины, и необходимо найти подпространство скрытых понятий для обновленной коллекции документов. .Чтобы избежать повторного вычисления матричной декомпозиции, существует два вида обновлений для установленного скрытого подпространства LSI: свертывание в новых документах и ​​свертывание в новых терминах.

3.5.1. Сворачивание в новых документах

Позвольте обозначить новые векторы документов, которые будут присоединены к исходной матрице терминов-документов; тогда матрица. Таким образом, новая матрица термин-документ имеет вид . Потом . То есть, если добавляется в исходную матрицу и . Однако здесь нет ортогональной матрицы типа .Таким образом, это не самая близкая матрица приближения к норме Фробениуса. По этой причине в ; более ухудшающие эффекты возникают при представлении матрицы аппроксимации SVD с использованием метода складывания.

Несмотря на это, чтобы сложить новые векторы документов в существующую декомпозицию SVD, проекция на диапазон текущих векторов термов (столбцы ) вычисляется по (5). Здесь ранг матрицы аппроксимации:

Что касается складывания этих новых векторов документов в установленное SVDC-разложение матрицы , мы должны сначала решить, к каким кластерным подматрицам должен быть присоединен каждый вектор.Затем, используя (5), мы можем свернуть вектор нового документа в подматрицу кластера. Предполагая, что это новый вектор документа , во-первых, евклидово расстояние между и ( является центром кластера подматрицы кластера ) вычисляется с использованием (6), где размерность , то есть количество терминов, используемых в . Один имеет

Второй добавляется в th кластер, где имеет минимальное евклидово расстояние с th кластером. То есть

В-третьих, (5) используется для обновления SVD . То есть

Здесь – ранг матрицы аппроксимации .Наконец, обновляется как с

Таким образом, мы завершаем процесс сворачивания вектора нового документа в декомпозицию SVDC, и центр тяжести кластера обновляется новым документом. Вычислительная сложность обновления SVDC зависит от размера и потому, что оно включает только одностороннее умножение матриц.

3.5.2. Свертывание в новых терминах

Обозначим набор векторов термов для обновления SVD. Потом матрица. Таким образом, мы имеем новый термин-документ , с . Потом .То есть и . Здесь не является ортонормированной матрицей. Таким образом, это не самая близкая матрица приближения к норме Фробениуса. Таким образом, чем больше членов добавляется в матрицу аппроксимации, тем больше отклонение между и которое будет вызвано в представлении документа.

Хотя указанный выше метод имеет недостаток SVD для свертки в новых терминах, у нас до сих пор нет лучшего метода для решения этой проблемы, если не требуется пересчет SVD. Для свертывания векторов терминов в существующую декомпозицию SVD проекция , на диапазон текущих векторов документов (строк ) определяется по формуле

Что касается свертывания в элементе , процесс обновления SVDC более сложен, чем СВД.Во-первых, вес в каждом документе каждого кластера вычисляется как

Здесь — вес нового члена в j -м документе подматрицы i -го кластера. — количество документов в и — количество кластеров в исходной матрице терминов-документов. Во-вторых, для каждого in Определения 2 процесс свертывания нового термина в SVD используется для обновления каждого показанного в

. Затем каждый обновляется с использованием

. as

Таким образом, мы завершаем процесс сворачивания в SVDC-разложение.Для складывания векторов термов в существующее разложение SVDC нам необходимо повторить процессы (11)–(14) для каждого элемента один за другим.

4. Эксперименты и оценка
4.1. Корпус

Reuters-21578, версия 1.0, используется для оценки производительности в качестве английского корпуса и доступен в Интернете (http://www.daviddlewis.com/resources/testcollections/reuters21578/). Он собирает 21 578 новостей из новостной ленты Reuters в 1987 году. Здесь представлены документы из 4 категорий: «сырая» (520 документов), «сельское хозяйство» (574 документа), «торговля» (514 документов) и «проценты» (424 документа). назначаются в качестве целевой коллекции документов на английском языке.То есть для оценки отбираются 2042 документа из этого корпуса. После стоп-слова (мы получаем стоп-слова из USPTO (Ведомство по патентам и товарным знакам США) патентную полнотекстовую базу данных и изображения по адресу http://patft.uspto.gov/netahtml/PTO/help/stopword.htm. Это включает около 100 обычных слов.Часть речи английского слова определяется с помощью QTAG, который представляет собой вероятностный теггер частей речи, который можно бесплатно скачать в Интернете: http://www.english.bham.ac.uk/staff/ omason/software/qtag.html) устранение и обработка корней (алгоритм Портера используется для обработки корней английского языка, который можно бесплатно загрузить в Интернете: http://tartarus.org/~martin/PorterStemmer/), общее количество предложений в этих документах составляет 50 837 предложений и 281 111 отдельных слов.

TanCorpV1.0 используется в качестве китайского корпуса в этом исследовании, которое доступно в Интернете (http://www.cnblogs.com/tristanrobert/archive/2012/02/16/2354973.html). Здесь документы из 4 категорий, таких как «сельское хозяйство», «история», «политика» и «экономика», назначаются в качестве целевого китайского корпуса. Для каждой категории из исходного корпуса случайным образом было отобрано 300 документов, в результате чего был получен корпус из 1200 документов.После морфологического анализа (поскольку китайский язык основан на иероглифах, мы провели морфологический анализ с использованием инструмента ICTCLAS. Это китайская система лексического анализа. Онлайн: http://ictclas.nlpir.org/), общее количество предложений составило 219 115 и 5 468 301 оцениваются отдельные слова.

4.2. Метод оценки

Мы используем меру сходства в качестве метода оценки производительности. Основное предположение, лежащее в основе измерения сходства, заключается в том, что сходство документов должно быть выше для любой пары документов, относящихся к одной и той же теме (внутритематическая пара), чем для любой пары, относящейся к разным темам (межтематическая пара).Это предположение основано на рассмотрении того, как документы будут использоваться приложениями. Например, при кластеризации текста по -средствам кластеры строятся путем сбора пар документов, имеющих наибольшее сходство при каждом обновлении.

В этом исследовании документы одной категории рассматриваются как имеющие одну и ту же тему, а документы разных категорий рассматриваются как кросс-тематические пары. Во-первых, пары документов создаются путем итеративного связывания каждого вектора документа в предопределенной категории и другого вектора документа во всем корпусе.Во-вторых, косинусное сходство вычисляется для каждой пары документов, и все пары документов сортируются в порядке убывания их сходства. Наконец, (15) и (16) используются для вычисления средней точности меры подобия. Подробнее о мере подобия можно узнать в [9]. Один имеет

Здесь обозначает пару документов, которая имеет наибольшее значение сходства среди всех пар документов. варьируется от 1 до и является общим числом пар документов. Чем больше средняя точность (), тем больше пар документов в одних и тех же категориях, которые считаются имеющими одну и ту же тему.То есть достигается лучшая производительность. Упрощенный метод может быть предопределен как фиксированные числа, такие как 10, 20 и 200 (как предложено одним из рецензентов). Таким образом, (16) не требуется. Однако из-за отсутствия знания оптимального , мы предполагаем, что средняя точность по всем возможным более убедительна для оценки производительности.

4.3. Экспериментальные результаты индексации

Как для китайского, так и для английского корпусов мы провели эксперименты по измерению сходства документов в каждой категории.При использовании SVDC в алгоритме 3 для LSI предопределенное количество кластеров в алгоритме кластеризации -Means устанавливается равным 4 для документов на китайском и английском языках, что равно количеству категорий, используемых в обоих корпусах. При кластеризации SOM при использовании SVDC в Алгоритме 4 для LSI массив нейронов задается для сопоставления исходных векторов документа с этим целевым пространством, а ограничение на итерацию по времени устанавливается равным 10 000. В результате китайские документы сопоставляются с 11 кластерами, а английские документы сопоставляются с 16 кластерами.В таблице 2 показаны значения -measure [26] результатов кластеризации, полученных с помощью кластеризации -Means и SOM соответственно. Чем больше значение -measure, тем лучше результат кластеризации. Здесь -Means дал лучшие результаты кластеризации, чем алгоритм кластеризации SOM.

0.6534

0
-Means SOM Clustering
0,7367 0.6046
Русский 0,7697

Средняя точность (см. (16)) На 4 категориях английских и китайских документов используется в качестве меры производительности. Таблицы 3 и 4 представляют собой экспериментальные результаты измерения подобия документов на английском и китайском языках соответственно. Для SVD, SVDC и ADE единственным требуемым параметром для вычисления скрытого подпространства является скорость сохранения, равная , где – ранг матрицы аппроксимации.Для IRR и SVR, помимо коэффициента сохранения, им также нужен еще один параметр в виде масштабного коэффициента для вычисления скрытого подпространства.


91 097 ВСД
91 097 9007

0,1

0,0185
PR-СВД SVDC (-средних) SVDC (СОК) SVR АДЭ
1.0 0,4373 ± 0,0236 0,4373 ± 0,0236 0.4373 ± 0,0236 0,4202 ± 0,0156 0,3720 ± 0,0253 0,3927 ± 0,0378
0,9 0,4382 ± 0,0324 0,4394 ± 0,0065 0,4400 ± 0,0266 0,4202 ± 0,0197 0,2890 ± 0,0271 0.3929 ± 0,0207
0,8 0,4398 ± 0,01855 0,4425 ± 0,0119 0,4452 ± 0,0438 0,4202 ± 0,0168 0.3293 ± 0,0093 0,3927 ± 0,0621
0,7 0,4420 ± 0,0056 0,4458 ± 0,0171 0,4385 ± 0,0287 0,4089 ± 0,0334 0,3167 ± 0,0173 0,3928 ± 0,0274
0,6 0.4447 ± 0,0579 0,4483 ± 0,0237 0,4462 ± 0,0438 0,4462 ± 0,0438 0,4201 ± 0,0132 0,3264 ± 0,0216 0,3942 ± 0,0243
0.5 0,4475 ± 0,0431 0,4502 ± 0,0337 0,4487 ± 0,0367 0,4203 ± 0,0369 0,3338 ± 0,0295 0,3946 ± 0,0279
0,4 0,4499 ± 0,0089 0,4511 ± 0,0173 0,4498 ± 0,0194 0,4209 ± 0,0234 0,3377 ± 0,0145 0,3951 ± 0,0325
0,3 0,4516 ± 0,0375 0,4526 ± 0,0235 0.4396 ± 0,0309 0,4222 ± 0,0205 0,3409 ± 0,0247 0,3970 ± 0,0214
0,2 0,4538 ± 0,0654 0,4554 ± 0,0423 0,4372 ± 0,0243 0,4227 ± 0,0311 0,3761 ± 0,0307 0,3990 ± 0,02615
0,1 0,4553 ± 0,0247 0,4605 ± 0,0391 0,4605 ± 0,0391 0,4298 ± 0,0275 0,4229 ± 0,0308 0,4022 ± 0.0170 0,3956 ±

0,0239

5 0.3006 ± 0,0208 9006 ± 0,0208

5 0,2730 ± 0,0134

5 0,2726 ± 0,290

0.3


PR СВД SVDC (-средних) SVDC (СОК) СВР Ade IRR
0,4312 ± 0,0213 0,4312 ± 0,0213 0,4312 ± 0,0213 0.4272 ± 0,0200 0,3632 ± 0,0286 0,2730 ± 0,0168
0,9 0,4312 ± 0,0279 0,4537 ± 0,0272 0,4463 ± 0,0245 0,4272 ± 0,0186 0,3394 ± 0,0303 0,2735 ± 0,0238
0,8
0,8 0,4358 ± 0,0422 0,4581 ± 0,0206 0,4458 ± 0,0239 0,4273 ± 0,0209 0,3136 ± 0,0137 0,2735 ± 0.0109
0,7 0,4495 ± 0,0387 0,4597 ± 0,0199 0,4573 ± 0,0146 0,4273 ± 0,0128 0,3075 ± 0,0068 0,2732 ± 0,0127
0,6 0,4550 ± 0,0176 0,4607 ± 0,0203 0,4547 ± 0,0294 0,4273 ± 0,030555 0,4273 ± 0,0305
0.573 ± 0,0406 0.4613 ± 0,0139 0,4588 ± 0,0164 0,4273 ± 0,0379 0,2941 ± 0,0173 0,2729 ± 0,0141
0,4 0,4587 ± 0,0395 0,4624 ± 0,0098 0,4659 ± 0,0255 0,4275 ± 0,0294 0,2857 ± 0,0194
0,4596 ± 0,0197 0,4644 ± 0,0183 0,4582 ± 0,0203 04285 ± 0,0305 0,2727 ± 0,0200 0,2666 ± 0,242
0,2 0,4602 ± 0,0401 0,4663 ± 0,0353 0,4432 ± 0,0276 0,4305 ± 0,0190 0,2498 ± 0,0228 0,2672 ± 0,0166
0,1 0,1 0,4617 ± 0,0409 0,4705 ± 0,0058 0,4513 ± 0,0188 0,4343 ± 0,0193 0,3131 ± 0,0146 0,2557 ± 0.0188

Для сравнения методов индексирования документов при различных настройках параметров коэффициент сохранения варьируется от 0,1 до 1,0 с шагом 0,1 для SVD, SVDC, SVR и ADE. Для SVR коэффициент масштабирования установлен равным 1,35, как это предложено в [10] для получения оптимальных средних результатов при поиске информации. Для IRR скорость сохранения установлена ​​равной 0,1, а масштабный коэффициент варьируется от 1 до 10, как и в [13]. Обратите внимание, что в таблицах 3 и 4 для IRR уровень сохранения 1 соответствует масштабному коэффициенту 10, 0.9 на 9 и так далее. Базовым уровнем метода можно считать чистый SVD при степени сохранности 1,0.

Из таблиц 3 и 4 видно, что для показателей сходства на английском и китайском языках SVDC с -Means, SVDC с кластеризацией SOM и SVD превосходят другие методы, основанные на SVD. В большинстве случаев SVDC с -Means и SVDC с кластеризацией SOM имеют лучшую производительность, чем SVD. Этот результат подтверждает нашу мотивацию SVD для кластеров в разделе 3.1, согласно которой все документы в корпусе не обязательно должны находиться в одном и том же скрытом пространстве, но в некоторых разных скрытых подпространствах.Таким образом, SVD на кластерах, который строит скрытые подпространства на кластерах документов, может характеризовать сходство документов более точно и правильно, чем другие методы, основанные на SVD. Здесь мы считаем, что дисперсии упомянутых методов сопоставимы друг с другом, поскольку они имеют близкие значения.

Принимая во внимание различия в средней точности для разных категорий, мы допускаем, что SVDC не может быть надежным подходом, поскольку его превосходство над SVD неочевидно (как указал один из рецензентов).Однако мы считаем, что дисперсии указанных методов сопоставимы друг с другом, поскольку имеют близкие значения.

Более того, SVDC с -Means превосходит SVDC с кластеризацией SOM. Лучшая производительность SVDC с -Means может быть связана с лучшей производительностью -Means, чем SOM ​​в кластеризации (см. Таблицу 2). Когда коэффициент сохранения снижается с 1 до 0,1, производительность SVDC с -Means и SVD значительно возрастает. Однако для SVDC с кластеризацией SOM его производительность снижается, когда сохранение меньше 0.3. Мы предполагаем, что SVDC с -Means эффективно улавливает скрытую структуру документов, но SVDC с кластеризацией SOM не улавливает соответствующую скрытую структуру из-за его плохой способности кластеризации документов.

Чтобы лучше проиллюстрировать эффективность каждого метода, используется классический -тест [27, 28]. Таблицы 5 и 6 демонстрируют результаты -теста производительности рассмотренных методов на английских и китайских документах соответственно. Использовалась следующая кодировка значений в диапазонах: «» («») означает, что значение меньше или равно 0.01, что указывает на убедительные доказательства того, что метод дает значительно лучшую (худшую) меру подобия, чем другой метод; «» («») означает, что значение больше 0,01 и меньше или равно 0,05, что указывает на слабое доказательство того, что метод дает значительно лучшую (худшую) меру подобия, чем другой; «» означает, что значение больше 0,05, что указывает на то, что сравниваемые методы не имеют существенных различий в производительности. Мы видим, что SVDC с -Means превосходит как SVDC с кластеризацией SOM, так и чистый SVD как в английском, так и в китайском корпусах.Между тем, SVDC с кластеризацией SOM имеет очень похожую производительность с чистым SVD.

SVD

Метод SVDC с ЗВОЛ кластеризацию

SVDC с -средних
SVDC с ЗВОЛ Кластеризация >

СВД

5


Метод SVDC с СОК кластеризацию

SVDC с -средних > >
SVDC с COMS Clustering
4.4. Экспериментальные результаты обновления

На рисунке 1 приведены характеристики процесса обновления SVD на кластерах по сравнению с обновлением SVD. Вертикальная ось указывает среднюю точность, а горизонтальная ось указывает коэффициент сохранения исходных документов для начального приближения SVDC или SVD. Например, коэффициент сохранения 0,8 указывает, что 80 процентов документов (терминов) в корпусе используются для аппроксимации, а оставшиеся 20 процентов документов (терминов) используются для обновления матрицы аппроксимации.Здесь коэффициенты сохранения матриц аппроксимации равномерно установлены равными 0,8. Мы только сравнили SVDC с -Means и SVD при обновлении, потому что SVDC с кластеризацией SOM не показала конкурентоспособной производительности по показателю сходства.


Из рисунка 1 видно, что при сворачивании новых документов процесс обновления SVDC с помощью -Means превосходит обновление SVD по показателю сходства. Очевидная тенденция в их разнице в производительности заключается в том, что превосходство SVDC с -Means становится все более и более значительным, чем SVD, когда количество обучающих документов уменьшается.Мы предполагаем, что меньшее разнообразие в скрытых пространствах небольшого количества учебных документов может улучшить сходство документов в одной и той же категории.

При складывании в новых терминах SVDC с -Means также превосходит SVD. Однако их производительность резко падает на начальном этапе и возрастает после достижения критического значения. Это явление можно объяснить тем, что при большом коэффициенте сохранения удаление все большего количества терминов индекса из матрицы терминов-документов будет нарушать скрытую структуру пространства документа.Однако, когда коэффициент удержания достигает небольшого значения (критического значения), скрытая структура пространства документа определяется главным образом добавленными терминами, число которых больше, чем оставшихся терминов. По этой причине сходство документов в корпусе определяется добавленными терминами указателя. Кроме того, мы наблюдаем, что критическое значение для китайского корпуса больше, чем для английского корпуса. Это можно объяснить тем, что количество индексных терминов на китайском языке (21475) намного больше, чем количество индексных терминов на английском языке (3269), но количество китайских документов (1200) меньше, чем количество английских документов (2402).Таким образом, структура скрытого пространства китайского языка гораздо более надежна, чем структура скрытого пространства английского языка, которое очень чувствительно к количеству терминов индекса.

В этом документе предлагается SVD для кластеров в качестве нового метода индексирования для скрытого семантического индексирования. Основываясь на обзоре современных тенденций линейных алгебраических методов для LSI, мы утверждаем, что современное состояние LSI примерно соответствует двум дисциплинам: методы LSI на основе SVD и методы LSI без SVD. Затем с уточнением его мотивации предлагается СВД на кластерах.Мы опишем алгоритм SVD на кластерах с двумя разными алгоритмами кластеризации: — Кластеризация средних и SOM. В этой статье представлены сложность вычислений SVD на кластерах, ее теоретический анализ и процесс ее обновления для складывания в новые документы и термины. SVD на кластерах отличается от существующих методов LSI на основе SVD тем, что устраняет шум из матрицы термин-документ. Он не изменяет веса сингулярных значений, как это делается в SVR и ADE, и не пересматривает направления сингулярных векторов, как это делается в IRR.Он адаптирует структуру исходной матрицы терминов-документов на основе кластеров документов. Наконец, для оценки предложенных методов с использованием меры подобия по сравнению с другими методами LSI, основанными на SVD, используются две коллекции документов: корпус на китайском и английском языках. Экспериментальные результаты показывают, что в большинстве случаев SVD на кластерах превосходит другие методы LSI на основе SVD. Более того, производительность методов кластеризации, используемых в SVD на кластерах, играет важную роль в ее производительности.

Возможными приложениями SVD в кластерах могут быть автоматическая категоризация большого количества веб-документов, где LSI является альтернативой для индексации документов, но с огромной сложностью вычислений и уточнением кластеризации документов, где мера сходства между документами имеет решающее значение для его производительности. Мы допускаем, что эта статья касается только методов линейной алгебры для скрытой сематической индексации. В будущем мы сравним SCD на кластерах с тематическими методами скрытого семантического индексирования по мере междокументного сходства, такими как вероятностное скрытое семантическое индексирование [29] и скрытое распределение Дирихле [30].

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано Национальным фондом естественных наук Китая в рамках грантов №. 71101138, 61379046, 301, 302 и 61432001; Пекинский фонд естественных наук по гранту №. 4122087; Фонды фундаментальных исследований для центральных университетов (buctrc201504).

Картирование локусов количественных признаков экспрессии генов с помощью разложения по сингулярным числам и анализа независимых компонентов | BMC Bioinformatics

Анализ отдельных признаков

Мы использовали данные, ранее описанные Brem et al. [31], которые измерили уровни экспрессии генов 6216 ORF в 112 сегрегантах, полученных в результате скрещивания штаммов Saccharomyces cerevisiae BY и RM.Уровень экспрессии каждого гена рассматривали как количественный признак (который мы будем называть признаком экспрессии гена), а eQTL определяли с помощью анализа сцепления с использованием 3312 генетических маркеров, распределенных по всему геному.

Нашей целью было изучить использование методов сокращения данных для картирования eQTL и сравнить его с традиционным анализом отдельных признаков. С этой целью мы сначала провели полногеномный анализ сцепления каждого из 6216 признаков экспрессии генов с помощью стандартных методов регрессии [32].Каждый признак был проверен на сцепление по всем 3312 маркерам, что составляет примерно 8 миллионов проверок гипотез. Значимые связи были обнаружены для 5013 признаков при частоте ложных открытий (FDR) 0,05 (см. Методы) [33]. Локусы с широко распространенными генетическими эффектами были идентифицированы путем разделения генома на неперекрывающиеся ячейки по 20 т.п.н. и подсчета количества связей в каждом интервале (рис. 1). Шестьдесят процентов всех связей пришлось на 36 бинов, в которых было более 20 связей. С большим количеством сегрегантов по сравнению с предыдущим исследованием [8] мы идентифицируем больший набор признаков экспрессии генов, которые связаны с каждой из ранее описанных горячих точек eQTL (см. Дополнительный файл 1).Горячие точки сцепления, полученные в результате анализа отдельных признаков, обобщены в таблице 1 и обеспечивают необходимую основу для сравнения анализов eQTL, основанных также на мета-признаках.

Таблица 1. Резюме анализов сцепления отдельных признаков Рисунок 1

Распределение сцеплений по всему геному по результатам анализа одиночных признаков . Геном дрожжей был разделен на неперекрывающиеся бины по 20 т.п.н. и было записано количество значимых связей с этим бином. В общей сложности 5013 признаков экспрессии генов показали значительное сцепление (FDR = 0.05) в анализе отдельных признаков. Вероятность того, что любой бин имеет 20 или более связей, меньше 2,1E-4. Это обозначено сплошной красной линией (Методы). Подробная информация о каждой горячей точке сцепления представлена ​​в таблице 1.

Уменьшение размерности с использованием SVD и ICA

SVD-анализ был выполнен для уменьшения размерности данных с исходных 6216 признаков экспрессии до 112 собственных признаков, где каждый собственный признак представляет собой линейную комбинацию все признаки экспрессии генов. Доля дисперсии, объясненной для каждого собственного признака, по отношению к общей вариации в наборе данных, показана на рисунке 2.Собственные признаки, которые случайно объясняли большую вариацию, чем ожидалось, были идентифицированы путем сравнения с нулевым набором данных (см. Методы), и в общей сложности для дальнейшего изучения были отобраны 20 лучших собственных признаков, которые в совокупности составляют примерно 72% всех вариаций.

Рисунок 2

Доля дисперсии, объясняемая каждым собственным свойством . Разложение по сингулярным значениям приводит к измерениям, которые мы называем «собственными признаками», которые ранжируются в соответствии с тем, насколько вариации в наборе данных они объясняют.Распределение дисперсии, объясненное для наблюдаемых и нулевых данных, показано синими и красными кружками соответственно.

Независимые моды из разложения на основе ICA были отсортированы по критерию Либермейстера [34] (см. Методы). Чтобы можно было сравнить тенденции изменчивости, зафиксированные двумя разными методами, мы выбрали 20 лучших признаков ICA, соответствующих 20 значимым собственным признакам, которые были проанализированы.

Поскольку каждый метапризнак представляет собой линейную комбинацию всех 6216 признаков экспрессии генов, было бы информативно вывести набор конкретных генов, которые вносят наибольший вклад в каждый из них.Чтобы идентифицировать эти гены, мы рассчитали корреляцию между каждым из 6216 признаков экспрессии генов с каждым метапризнаком и определили значительно коррелирующие гены с помощью перестановок (см. Методы). Как показано в таблицах 2 и 3, количество значительно коррелированных ( p < 0,0001) признаков экспрессии генов колеблется от 5 до 1919 (см. Дополнительный файл 2) и от 3 до 1448 (см. Дополнительный файл 3) для каждого собственного признака и признака ICA. соответственно.

Таблица 2. Сводка анализа сцепления собственных признаков и онтологии генов Таблица 3. Сводка анализа сцепления ICA-признаков и онтологии генов

20 лучших мета-признаков (таблицы 2 и 3, [35]).Для 12 из 20 собственных признаков значительно коррелированные гены демонстрируют чрезмерную представленность терминов GO, связанных с конкретными биологическими процессами, такими как почкование, метаболизм аминокислот, стеролов и углеводов, а также биогенез рибосом, что в целом согласуется с предыдущим анализом [8]. Аналогичное обогащение терминов GO было обнаружено для 17 из 20 признаков ICA с обнаружением дополнительных категорий, таких как ретро-транспозон, активность алкогольдегидрогеназы и кислой фосфатазы (таблица 3). В дополнение к расширенному набору признаков с общим биологическим процессом, которые были описаны в более ранних исследованиях eQTL, мы определили четыре новые группы признаков, которые до сих пор не были идентифицированы с помощью анализа сцепления.Два из них, Eigentraits 4 и 19, определяются кластерами генов со сходной функцией и будут описаны более подробно ниже. Два других, признаки ICA 7 и 9, связаны с активностью ретротранспозона и активностью алкогольдегидрогеназы соответственно.

Анализ сцепления метапризнаков

Для 20 основных метапризнаков мы провели полногеномный анализ сцепления с использованием 3312 генетических маркеров, которые были генотипированы в каждом сегрегранте. Анализ сцепления выполняли путем регрессии маркерных генотипов по значениям признаков для каждого метапризнака, а значимость определяли по перестановкам.Мы считали маркеры значимыми в соответствии с частотой полногеномных ошибок, основанной на перестановках, равной 5% [36]. Полногеномный анализ сцепления для каждого собственного признака и признака ICA показан на рисунке 3 и рисунке 4 соответственно. В общей сложности 14 собственных признаков демонстрируют значительную связь с одним или несколькими местами в геноме, что дает в общей сложности 15 уникальных eQTL. Каждый собственный признак 2, 4, 5, 6, 8 и 12 связан с двумя eQTL, а собственный признак 7 связан с тремя eQTL. Аналогичный анализ признаков ICA привел к обнаружению 20 уникальных eQTL ( p < 0.05, табл. 3), которые были распределены по 17 признакам ICA. Признаки ICA 1, 15 и 18 показали связи с двумя eQTL, тогда как признак ICA 16 связан с четырьмя eQTL. При полногеномной частоте ошибок 5 % мы ожидаем два ложноположительных результата среди 45 eQTL, признанных значимыми.

Рисунок 3

Анализ сцепления генома для 20 лучших собственных признаков . В каждом профиле сцепления отрицательное логарифмическое p-значение статистики сцепления для каждого собственного признака нанесено на график относительно геномного положения всех маркеров.Значимость определяется GWER <0,05. Четырнадцать из 20 собственных признаков показывают связь по крайней мере с одним QTL. Допуск устанавливается на уровне 1E-10 для p-значений, равных нулю.

Рисунок 4

Анализ сцепления всего генома для 20 основных признаков ICA . В каждом профиле сцепления отрицательное логарифмическое p-значение статистики сцепления для каждого признака ICA нанесено на график относительно геномного положения всех маркеров. Значимость определяется GWER <0,05. Семнадцать из 20 признаков ICA показывают связь по крайней мере с одним QTL.Допуск устанавливается на уровне 1E-10 для p-значений, равных нулю.

Десять из 21 идентифицированного уникального eQTL сопоставляются с ранее описанными областями транс--регуляторных горячих точек [1], которые регулируют группы генов с общими биологическими функциями, такими как катаболизм аминокислот (собственный признак 2, ICA-признак 8), спаривание (собственный признак 3, ICAпризнак 2), митохондрии (собственный признак 6, ICAпризнак 1) и метаболизм гема/жирных кислот (собственный признак 10, ICAпризнак 11). Для каждого из этих метапризнаков мы наблюдали соответствующее обогащение связанных терминов GO в наборе коррелированных признаков (таблица 2 и таблица 3).

Результаты полногеномного сцепления метапризнаков, полученных из SVD и ICA, показывают значительное совпадение (рис. 5). Перекрывающиеся eQTL в первую очередь соответствуют локусам, которые проявляют широко распространенную изменчивость экспрессии, и включают eQTL с сильными эффектами trans , что согласуется с тем фактом, что и SVD, и ICA смогли захватить основные источники изменчивости своими высокоранговыми компонентами. Из одиннадцати новых eQTL четыре продемонстрировали наличие связи cis , что будет более подробно обсуждаться ниже.Другие связи сопоставляются с областями генома, которые либо не показывают значительного обогащения связей по результатам анализа одного признака, либо нет очевидного гена, объясняющего обогащение аннотации GO для этого мета-признака.

Рисунок 5

Наложение результатов сканирования сцепления отдельных признаков с анализом сцепления собственных признаков . По оси ординат верхней панели представлено количество связей, которые приходятся на каждые 20 т.п.н. неперекрывающихся областей, разбросанных по всему геному, а по оси абсцисс отмечено положение генотипированных маркеров, по которым оценивалось сцепление.Следующие два ряда сплошных кружков отмечают положение eQTL, обнаруженных для собственных признаков и признаков ICA соответственно. Положение совмещено с маркерами на оси X верхнего графика. Красные сплошные кружки представляют новые eQTL, а черные — ранее описанные eQTL.

На рис. 6 показаны общие связи между собственными признаками. Каждый график соответствует общему eQTL, который показывает связь с разными собственными признаками. Эти регионы потенциально могут содержать либо плейотропные eQTL, либо два или более связанных eQTL.

Рисунок 6

Перекрытие местоположения QTL по ортогональным собственным признакам . На каждом графике длина перекрытия между местоположениями eQTL по нескольким собственным признакам представлена ​​интервалом поддержки 1 LOD, который обозначен черными полосами. Кроме того, для каждого графика расположение предполагаемого регулятора, который может объяснить обогащение определенных функциональных категорий ГО для признаков, коррелирующих с конкретными собственными признаками, представлено по оси x синими вертикальными полосами.

Анализ предполагаемых цис-действующих метапризнаковых сцеплений

При традиционном сканировании сцепления, когда признаки анализируются по одному, цис--сцепление характеризуется как признак экспрессии, демонстрирующий связь с собственным геномным местоположением. При сканировании сцепления метапризнаков мы определяем цис -связь метапризнака как связь с геномным положением признака, который также значительно коррелирует с этим метапризнаком. В следующих разделах мы опишем подробный анализ четырех новых -цис--связей, которые не были описаны в предыдущих исследованиях eQTL.К ним относятся собственные признаки 4 и 19, а также признаки ICA 7 и 9, которые демонстрируют значительное обогащение терминов аннотаций GO.

Цис-регуляция метаболизма аспарагиназы

Собственный признак 4 имеет сильное цис--сцепление на хромосоме 12 (рис. 3). В этом регионе находятся гены, участвующие в катаболизме аспарагиназы при азотном голодании ( ASP3 -1, ASP3 -2, ASP3 -3, ASP3 -4; см. дополнительный файл 4). Есть 13 признаков экспрессии, которые значительно коррелируют с этим собственным признаком ( p < 0.0001), а четыре верхних коррелированных гена составляют тандемный набор генов аспарагиназы ( ASP ). Девять оставшихся значительно коррелированных генов являются сильными кандидатами на участие в сети метаболизма аспарагиназы. Сравнительный анализ последовательностей с опубликованным проектом последовательности генома RM [37] выявил отсутствие кластера генов ASP в штамме RM, что согласуется с тем, что eQTL подтверждается самой высокой F-статистикой среди всех связей и небольшим количеством гены, которые вносят основной вклад в этот конкретный собственный признак.

Цис-регуляция транспорта натрия

Собственный признак 19 также демонстрирует наличие цис--сцепления на хромосоме 4. Этот собственный признак обогащен генами, участвующими в транспорте натрия. Гены с наибольшей корреляцией с собственным признаком 19 представляют собой группу из генов ENA ENA5 , ENA2 и ENA1 , которые являются членами семейства АТФаз оттока натрия и охватывают участок хромосомы 4, который окружает сцепленный eQTL (см. Дополнительный файл 4).Анализ последовательности черновика генома RM для группы генов ENA показывает совпадение выравнивания с одной копией гена ENA на суперконтиге 1, что предполагает, что копии генов ENA были удалены вдоль линии RM как в противном случае можно было бы ожидать выравнивания всех трех копий. Это наблюдение согласуется с гипотезой о возможных изменениях количества копий, существующих в этом локусе между двумя штаммами. Однако предварительный статус генома не позволяет сделать более определенный вывод об изменении числа копий.

Цис-регуляция активности ретротранспозонов

Шестьдесят три гена достоверно коррелируют с ICA-признаком 7 ( p <0,0001), и один значимый eQTL был картирован на хромосоме 5 (рис. 4). Как показывает GO-анализ 63 генов, большая часть этих генов является мобильными элементами и/или вовлечена в процесс ретротранспозиции. Профиль многоточечного сцепления eQTL на хромосоме 5 показывает расположение подмножества генов, которые лежат в интервале поддержки 1 LOD (см. Дополнительный файл 5).Ген YERCTy1-1, ретротранспозон семейства Ty1, присутствует в интервале поддержки eQTL, а также значительно коррелирует с признаком ICA 7. Это подтверждает гипотезу о том, что YERCTy1-1 является возможным геном-кандидатом, лежащим в основе этого eQTL.

Дальнейший анализ данных последовательности был выполнен с использованием опубликованного проекта последовательности RM. Выравнивание гена, а также части его восходящей и нисходящей геномной последовательности в двух штаммах указывает на возможный инсерционно-делеционный полиморфизм, охватывающий весь ретро-транспозон.Предупреждением для этого наблюдения является возможная ошибка выравнивания, которая может возникнуть из-за высокой степени гомологии в различных семействах мобильных элементов и несобранного состояния генома RM. Это не исключает наличия полиморфизма, лежащего в основе eQTL, но затрудняет обнаружение с использованием доступных в настоящее время данных о последовательностях.

Цис-регуляция активности алкогольдегидрогеназы

Признак 9 ICA состоит из 22 значительно коррелированных генов, которые обогащены активностью алкогольдегидрогеназы и ферментацией.Из 22 генов только YJL056C попадает в интервал поддержки 1 LOD eQTL на хромосоме 10 (см. Дополнительный файл 5). YJL056C представляет собой фактор транскрипции, который связывается с промоторными элементами, чувствительными к цинку, чтобы индуцировать транскрипцию в присутствии цинка. Другие гены в коррелированном наборе включают группу ферментов ADH , которые представляют собой алкогольдегидрогеназы, участвующие в ферментации и гликолитическом пути. Транскрипция этих генов активируется во время дефицита цинка, что также подтверждается наличием переносчиков цинка, таких как ZRT3 и ZRT2 , в наборе коррелирующих генов.Эти наблюдения позволяют предположить, что ZAP1 является возможным геном-кандидатом, лежащим в основе eQTL. Мы выполнили множественное выравнивание кодирующей последовательности ZAP1 из двух штаммов Saccharomyces cerevisiae , BY и RM, а также двух родственных видов Saccharomyces mikatae и Saccharomyces paradoxus . Из 19 обнаруженных однонуклеотидных полиморфизмов 10 привели к несинонимичным изменениям (см. Дополнительный файл 6). Эти полиморфизмы являются сильными кандидатами для дальнейшего вычислительного и функционального анализа, чтобы сузить eQTL, лежащий в основе признака ICA 9, до уровня нуклеотидов.

Мутация витреоретинальной дегенерации (SVD) Snowflake R162W обеспечивает новое понимание структуры и функции ионных каналов Kir7.1

Abstract

Витреоретинальная дегенерация (SVD) типа «снежинка» связана с мутацией R162W калиевого канала внутреннего выпрямления Kir7.1. Kir7.1 находится на апикальной мембране клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE), рядом с нейронами фоторецепторов. Фенотип SVD варьируется от дегенерации RPE до аномальной b-волны и жидкого стекловидного тела.Мы стремились определить, как эта мутация изменяет структуру и функцию человеческого канала Kir7.1. В этом исследовании мы экспрессировали конструкцию Kir7.1 с мутацией R162W в клетках CHO для оценки функции ионного канала. По сравнению с белком дикого типа мутантный белок демонстрировал нефункциональный канал Kir, что приводило к деполяризации мембранного потенциала в состоянии покоя. При совместной экспрессии с Kir7.1 дикого типа мутант R162W показал снижение I Kir7.1 и положительный сдвиг в текущем потенциале «0».Моделирование гомологии, основанное на структуре бактериального белка канала Kir, показало, что эффект мутации R162W является результатом потери водородных связей регуляторным связывающим липид доменом цитоплазматической структуры.

Образец цитирования: Pattnaik BR, Tokarz S, Asuma MP, Schroeder T, Sharma A, Mitchell JC, et al. (2013) Мутация R162W при витреоретинальной дегенерации (SVD) Snowflake дает новое представление о структуре и функции ионных каналов Kir7.1. ПЛОС ОДИН 8(8): е71744.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071744

Редактор: Макото Канзаки, Университет Тохоку, Япония

Получено: 5 апреля 2013 г.; Принято: 2 июля 2013 г.; Опубликовано: 19 августа 2013 г.

Авторское право: © 2013 Pattnaik et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана кафедрой педиатрии Университета Висконсин-Мэдисон (DMP, BRP), Высшей школой (DMP), Школой медицины и общественного здравоохранения (DMP, BRP) и Rebecca Профессорство Мейера Брауна (BRP) Исследовательского института UW-Eye, финансируемого Фондом исследований сетчатки. Реагенты для трансфекции были любезно предоставлены компанией Mirus Bio LLC (Мэдисон, Висконсин) в рамках премии Mirus Research Award компании BRP. Проект также был частично поддержан программой премии клинических и трансляционных наук (CTSA) Национального института здравоохранения (NIH) (NCRR-1UL1RR025011 и NCATS-9U54TR000021) и Центром стволовых клеток и регенеративной медицины UW-Stem Cell & Regenerative Medicine (BRP).Финансирование было предоставлено NCRR-P51 RR000167 Висконсинскому национальному исследовательскому центру приматов (WNPRC) в Университете Висконсин-Мэдисон, Фонду борьбы со слепотой (AOE) и NIH-EY014467 (AOE). Это исследование частично проводилось в учреждении, построенном при поддержке больницы Меритер (DMP). TS получил летнюю студенческую стипендию от Fight for Sight и грант в поддержку исследований от Sigma Xi. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: ООО «Мирус Био» частично финансировало это исследование и помогло приобрести реагенты для трансфекции. Нет никаких дополнительных патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, которые нужно декларировать. Это не меняет приверженности авторов всем политикам PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Точечная мутация в KCNJ13 , гене, кодирующем белковые субъединицы внутренне ректифицирующего калиевого канала Kir7.1, связан с аутосомно-доминантной витреоретинальной дегенерацией типа «снежинка» (SVD) [1]. Kir7.1 является членом семейства каналов Kir и экспрессируется преимущественно в сетчатке [2], [3]. Классические признаки SVD включают снежные отложения в сетчатке, очаговую дегенерацию пигментного эпителия сетчатки (RPE), умеренную миопию, оптически пустое стекловидное тело и редуцированную скотопическую b-волну. У пациентов с СВД также развиваются выемки роговицы, неотличимые от таковых при типичной дистрофии роговицы Фукса [4], [5].

Трансмембранный поток ионов через множество ионных каналов, транспортеров и насосов поддерживает транспорт эпителиальной жидкости и поддерживает разнообразные физиологические функции [6]. В сетчатке канал Kir7.1 обнаружен в апикальных отростках RPE на границе с внешним сегментом фоторецептора [7]. Kir7.1 обеспечивает прохождение K + в клетки RPE и из них, тем самым способствуя ионному гомеостазу в субретинальном пространстве [8]. Таким образом, канал Kir 7.1 поддерживает многие аспекты физиологии ПЭС, включая поддержание мембранного потенциала, рециркуляцию ионов калия и направленный транспорт жидкости, где поток ионов транс-ПЭС имеет решающее значение для поддержания связи между ПЭС и сетчаткой, которая необходима для зрение [9], [10].Каналы Kir состоят из четырех белковых субъединиц, каждая из которых содержит N-концевую цитоплазматическую петлю, два трансмембранных сегмента, одну P-петлю селективности и цитоплазматический C-концевой регуляторный домен [2], [11]. Мутация SVD R162W локализована в консервативном кластере С-концевых основных остатков. На крысиной мутантной модели Kir7.1 Hejtmancik и коллеги показали, что замена остатка аргинина (R) в положении 162 на триптофан (W) приводит к неселективному каналу с утечкой [1] с реверсивным потенциалом, близким к нулю.В дополнение к точечной мутации в положении 162 крысиный клон имел дополнительную восходящую мутацию: A139S. Фенотип Kir7.1, описанный в крысиной модели, осложнен этой второй мутацией и, таким образом, не может быть идеальной моделью патогенеза везикулеза. Наша работа отличается от более ранней публикации тем, что мы исключили любые потенциальные прямые эффекты от второй мутации или любое взаимодействие между двумя мутациями, которое могло бы привести к различному поведению мутантного канала Kir7.1 крысы in vivo и in vitro чем его человеческий аналог.Также возможно, что существуют тонкие различия в отношениях структура-функция между каналом Kir крысы и человека.

Неясно, каким образом каналопатия апикальной мембраны ПЭС приводит к целому ряду глазных патологий, включающих ПЭС, сетчатку, стекловидное тело и роговицу. Точно так же мало известно о том, как функция мутантного человеческого канала Kir7.1 связана с фенотипом, ассоциированным с SVD. В этой статье мы экспрессировали как каналы Kir7.1 человека дикого типа, так и мутантные каналы R162W человека в клетках млекопитающих CHO и HEK.Используя цельноклеточную конфигурацию метода patch-clamp, мы охарактеризовали функциональные различия между каналами дикого типа и мутантными каналами. Слияние флуоресценции позволило визуализировать мембранную экспрессию белков дикого типа и мутантных белков. Структурные изменения, вызванные этой мутацией, анализировали с помощью молекулярного моделирования.

Материалы и методы

Реагенты

Все химические реагенты были получены от Fisher Scientific (Питтсбург, Пенсильвания) или Sigma (Санкт-Петербург).Луи, Миссури).

Культура клеток

Клетки

CHO-K1 (ATCC, Manassas, VA) были выбраны, потому что они не имеют эндогенной экспрессии каналов Kir [12]. Клетки поддерживали в среде HAMs F-12 с добавлением 5% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина при 37°C во влажном инкубаторе с 5% CO 2 [12]. Среду меняли с интервалом 2–3 дня, клетки использовали в течение 15 пассажей. HEK-293, еще одна установленная клеточная линия, часто используемая для изучения гетерологичной экспрессии ионных каналов [13], культивировали в EMEM (минимальная основная среда Игла), содержащей 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина, как указано выше.Среду меняли каждые 2–3 дня, клетки делили еженедельно.

Плазмидные векторы и трансфекция

Для экспрессии канала Kir7.1 и изучения его электрофизиологии полноразмерный клон кДНК человеческого KCNJ13 (NM_002242.2), клонированный в эукариотический вектор экспрессии pCMV6-XL5, был получен от ORIGENE (кат. № TC128213, Роквилл, Мэриленд) . Чтобы создать конструкцию N-концевого белка зеленой флуоресценции (GFP), мы амплифицировали открытую рамку считывания KCNJ13, фланкированную сайтами рестрикции EcoR1 и Bamh2, с использованием пар праймеров:

.

Прямой (5′-GCTTCGAATTCCGACAGCAGTAATTGC-3′) и обратный (5′-ATCCGGTGGATCCTTATTGTCAGTCC-3′).

Амплифицированный продукт клонировали в сайт множественного клонирования (MCS) вектора pEGFP-C1 (Clontech Laboratories Mountain View, CA). Мутантный клон был создан путем введения мутации (484 C>T) в клон KCNJ13 дикого типа (NM_002242.2) с использованием набора «Quick-Change Site-Directed Mutagenesis Kit» от Stratagene (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, США). КА). Мы создали слитую конструкцию N-конца mCherry, используя сайты клонирования рестрикции EcoR1 и Bamh2 в MCS вектора pmCherry-C1 (Clontech Laboratories Inc.Маунтин-Вью, Калифорния), как описано выше для слитой конструкции дикого типа. mCherry представляет собой мономерный белок. Создав меченый мутантный белок, мы смогли определить совместную локализацию белков GFP и mCherry, соответствующих каналам Kir7.1 дикого типа и мутантам соответственно. Мы изучили одну плазмиду дикого типа (pEGFP-hKir7.1) и две мутантные гибридные плазмиды (pEGFP-R162W и pmCherry-R162W). Состав каждой конструкции был подтвержден секвенированием.

клетки CHO-K1 (400 000 клеток на чашку для культивирования 35 мм) трансфицировали либо с использованием реагентов TransIT-CHO (Mirus Bio LLC, Madison, WI), либо путем нуклеофекции (Lonza, Walkersville, MA) в соответствии с рекомендациями производителей.Клетки НЕК-293 трансфицировали нуклеофекцией. Мы использовали следующие комбинации плазмид для трансфекции: 1) pEGFP-hKir7.1 плюс pmCherry, или 2) pmCherry-R162W плюс pEGFP, или 3) pEGFP-hKir7.1 плюс pmCherry-R162W. Два мкг плазмидной ДНК (1 мкг на плазмиду) трансфицировали на культуральную чашку диаметром 35 мм. Клетки трипсинизировали через 24 часа после трансфекции, высевали на покровные стекла 12 мм #1 и исследовали в пределах от 24 до 72 часов после трансфекции.

Электрофизиологическая запись

Токи

каналов Kir регистрировали электрофизиологическим методом патч-кламп цельных клеток при комнатной температуре с использованием усилителя Axopatch 200B (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния) и системы сбора данных Digidata 1440A (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния).Данные были подвергнуты низкочастотной фильтрации на частоте 1 кГц и оцифрованы на частоте 0,5 кГц. Покрытые клетками покровные стекла помещали на дно 13-мм камеры, установленной на неподвижном предметном столике микроскопа Nikon FN-1, и непрерывно перфузировали, используя следующий раствор ванны (HR), в мМ: 135 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 10 глюкоза, 1,8 CaCl 2, и 1 MgCl 2 . pH доводили до 7,4 с помощью NaOH. Мы заменили 20 мМ Cs + на Na + в растворе ванны, чтобы заблокировать Kir7.1 канал ток. Для определения селективности каналов Kir7.1 соль Na + в растворе Рингера заменяли либо 135 мМ K + , либо Rb + в ванне. Быстрый обмен раствора в регистрационной камере был достигнут с помощью системы самотечной подачи, управляемой клапанами, запрограммированными на компьютере (Pattnaik, неопубликовано).

Пипетки Patch

были изготовлены из боросиликатного стекла (BF150-117-10, Sutter Instruments, Novato, CA) с использованием горизонтального съемника пипеток (P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) и отполированы огнем (MF-830, Narishige, Tokyo). , Япония).Регистрирующие электроды, заполненные (в мМ) 30 KCl, 83 K-глюконатом, 10 HEPES, 5,5 EGTA, 0,5 CaCl 2 , 4 Mg-ATP и 0,1 GTP и доведенные до pH 7,2 с помощью KOH, измеряли сопротивление наконечника в пределах 2,5–3,5 МОм. В качестве электрода сравнения использовали насыщенный солевой агаровый мостик. Емкость всей ячейки и последовательное сопротивление контролировались и компенсировались на протяжении всей записи. Ток контролировали либо с помощью линейного изменения напряжения от -160 мВ до +40 мВ, либо с помощью последовательности скачков напряжения от -160 мВ до +50 мВ.В промежутках между записями ячейку поддерживали при -10 мВ. В каждой из наших записей мы используем термин «входящий ток» для обозначения входящего потока ионов K + . Все записи проводились при комнатной температуре.

Антитела

Поликлональные антитела

Kir7.1 были щедрым подарком доктора Брета Хьюза (Мичиганский университет, Анн-Арбор). Моноклональное конусообразное антитело 7G6 было любезно предоставлено доктором Питером Маклишом (Медицинская школа Морхаус, Атланта, Джорджия). Поликлональные антитела Kir7.1 от Osenses (Osenses Pty Ltd., Кесвик, Австралия) и моноклональное антитело к β-актину от LI-COR Biosciences (Линкольн, Небраска).

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Macaca mulatta глаз были получены из Висконсинского национального исследовательского центра приматов в течение 1 часа после эвтаназии для других не связанных исследований. Хрусталик переднего сегмента и стекловидное тело были удалены хирургическим путем. Наглазник фиксировали в 4% параформальдегиде и 2 штук длиной 1 см заключали в блоки ОКТ. Срезы замороженной ткани размером 10 мкм собирали на заряженных предметных стеклах и замораживали при -80°C до использования.Срезы размораживали при комнатной температуре и регидратировали в PBS перед проведением иммуногистохимии. После блокирования 5% козьей сывороткой и пермеабилизации клеток 0,2% Triton X-100 предметные/покровные стекла окрашивали путем инкубации с соответствующими первичными антителами в блокирующем буфере в течение ночи при 4°C. Образцы трижды промывали в PBS с последующим воздействием вторичных антител, конъюгированных с флуорофором, в течение 2 ч при комнатной температуре. Предметные/покровные стекла промывали и монтировали с помощью Fluoromount (Sigma-Aldrich Corp., Сент-Луис, Миссури) и высушивают. Все флуоресцентные изображения были получены с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Nikon FN1 и проанализированы с использованием элементов NIS (Nikon, Melville, NY). В случае режима сканирования XYZ была получена последовательность кадров XY с интервалом 0,1 мкм по толщине Z.

Визуализация живых клеток

Мы использовали NucBlue™ (Life Technologies, Нью-Йорк) для окрашивания ядер и набор для анализа ER-ID™ Red (Enzo Life Sciences, PA) для окрашивания эндоплазматического ретикулума. Через сутки после нуклеофекции (Lonza, Германия) клетки на покровном стекле инкубировали в растворе, содержащем по 1 мкл ER-ID и Hoechst в 1X буфере для анализа (набор ER-ID), и инкубировали в течение 30 минут при 37°C в темный.Клетки промывали один раз буфером для анализа 1X (набор ER-ID) и помещали в камеру для визуализации (магнитные камеры с быстрым высвобождением, Warner Instruments, CT). Клетки визуализировали с использованием иммерсионного объектива с увеличением 60X (вода Plan Apo 60X, числовая апертура 1,0) в растворе Рингера. Анализ данных в автономном режиме выполняли с использованием NIS-Elements (Nikon USA, NY), а интенсивность флуоресценции определяли с помощью функции линейного сканирования.

Вестерн-блот

Цельноклеточные лизаты из трансфицированных клеток готовили с использованием буфера RIPA (150 мМ NaCl, 1.0% NP-40, 0,5% DOC, 0,1% SDS, 50 мМ трис, pH 8,0). Лизаты центрифугировали для отделения растворимого экстракта от нерастворимых частей и частей клеточного дебриса. Растворимые лизаты разделяли с помощью гель-электрофореза в 4–12% SDS-PAGE и переносили на мембраны Immobilon-FL PVDF (Millipore, Billerica, MA). Мембраны блокировали блокирующим буфером Odyssey: PBS с 0,2% Tween 20 (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). После переноса белков на мембрану мы визуализировали интересующий белок путем иммунного окрашивания вестерн-блотов моноклональным анти-Kir7.1 (разведение 1∶250) или антитела к β-актину (1∶8000). Первичные антитела разбавляли 1:1 блокирующим буфером Odyssey. Первичные антитела выявляли с помощью вторичных антител, меченных флуоресцентными красителями ближнего инфракрасного диапазона IRDye800 и IRDye700 (LI-COR Biosciences, Линкольн, Небраска), чтобы обеспечить двухцветную визуализацию и наложение полос. Вторичные антитела разбавляли 1∶15000 в 1∶1 буфере Odyssey Blocking: PBS, 0,2% Tween 20. Белки визуализировали путем сканирования блотов с помощью LI-COR Odyssey Infrared Imager (Lincoln, NE).Уровни белка Kir7.1 и β-актина определяли количественно с использованием программного обеспечения LI-COR Odyssey Infrared Imager версии 1.2. Общие уровни белка Kir7.1 дикого типа и мутантного белка нормализовали по отношению к β-актину, а затем определяли соотношения между Kir7.1 дикого типа, мутантом R162W и Kir7.1 дикого типа плюс мутант R162. Эксперименты проводили в трех экземплярах и определяли SEM.

Молекулярное моделирование

Сравнительная трехмерная модель белка Kir7.1 была создана с использованием кристаллической структуры Kir2.2 в качестве шаблона (номер доступа к базе данных белков 3SPI) [14]. Эта структура представляет собой общую конфигурацию мембраны канала Kir в ассоциации с молекулами PIP 2 . Аналогично, кристаллическая структура 3SPG послужила шаблоном для создания модели структуры мутантного белка Kir7.1R162W с PIP 2 [14]. Эти структуры были решены с помощью автоматизированного сравнительного моделирования белков с помощью MODELLER (http://salilab.org/modeller/) [15]. Преимущество использования MODELLER в этом контексте состоит в том, что он может моделировать все четыре мономера одновременно, что приводит к более реалистичной модели тетрамерной сборки.

Анализ данных и статистические методы

Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего по более чем 5 наблюдениям. Все данные, полученные с помощью pClamp-10, были проанализированы Clampfit (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), а результаты были импортированы в Excel (Microsoft) для статистического анализа. Мы использовали критерий Стьюдента для определения статистической значимости, определяемой значениями P <0,05. Данные представлены как среднее ± SEM, если не указано иное. Графики и рисунки были сделаны с использованием Origin (Origin Lab, MA) и PowerPoint (Microsoft).

Результаты

Локализация белка Kir7.1 в сетчатке глаза приматов

Фенотипы сетчатки и стекловидного тела, наблюдаемые у пациентов с СВД, позволяют предположить, что Kir7.1 играет важную роль в сетчатке. Вопрос о том, действительно ли Kir7.1 присутствует в сетчатке, является предметом споров, хотя экспрессия Kir7.1 была продемонстрирована в апикальных отростках RPE [7], [16], [17]. Чтобы подтвердить локализацию Kir7.1 в сетчатке приматов, мы провели иммуногистохимию на RPE и замороженных срезах сетчатки тканей плода и взрослого человека, а также тканей взрослых обезьян.Срезы сетчатки взрослых обезьян показаны на рис. 1. Окрашивание Kir7.1 (красный) с использованием хорошо охарактеризованного поликлонального антитела [7] наблюдали в заметном монослое в задней части сетчатки, в основном в слое клеток RPE. При увеличении в 100 раз (рис. 1А) окрашивание Kir7.1 наблюдалось вблизи кончика внешних сегментов колбочкового фоторецептора, что согласуется с экспрессией в RPE. Подтверждение окрашивания, характерного для апикального отростка клеток RPE, было получено из последующего изображения с большим увеличением (рис. 1B 600X и C 1000X) и реконструкции изображения с использованием оптических срезов Z-стека (рис.1Б). Локализация каналов Kir7.1 в RPE также была обнаружена как в срезах тканей взрослых [18], так и в срезах тканей плода человека (данные не показаны). Заметная локализация канала Kir7.1 в апикальных отростках RPE подтверждает роль каналов Kir7.1 в гомеостазе калия в субретинальном пространстве. Наши результаты с использованием сетчатки приматов согласуются с предыдущими сообщениями на крысиной и человеческой модели о том, что Kir7.1 локализуется в апикальных отростках RPE [16], [18]. Ни один из подходов не продемонстрировал специфического окрашивания Kir7.1 внутри нервной сетчатки, однако [7], [16], [17], [19].

Рисунок 1. Каналы Kir7.1 локализованы в апикальных отростках взрослых клеток РПЭ резус.

( A ) Изображение замороженного среза при малом увеличении (10X, NA 0,30), показывающее иммуноположительное окрашивание Kir7.1 слоя клеток RPE. Kir7.1 (красный) был обнаружен в слое клеток RPE, но не обнаружен в нейральной сетчатке. Фоторецепторы колбочек (PR) иммунопозитивны в отношении аррестина колбочек (зеленый). Ядерное окрашивание (синий цвет) показывает неповрежденную структуру сетчатки.( B ) Изображения, полученные с использованием объектива 60X (вода 60X, числовая апертура 1,0), показывают увеличенный внешний ядерный слой (ONL) и слой клеток RPE. Были получены изображения сетчатки по Z-стеку для создания трехмерного реконструированного изображения. Изображение над верхней белой линией ( B ) представляет собой оптическое сечение в точке горизонтального курсора, а изображение справа от вертикальной белой линии представляет собой оптическое сечение вертикального курсора. Обратите внимание на апикальную локализацию сигнала красной флуоресценции (стрелка), который присутствует перед окрашиванием ядер RPE.( C ) Изображение с большим увеличением (100-кратное масло, NA 1,4), показывающее 4 соседних клетки RPE, иллюстрирующее распределение иммуноокрашивания Kir7.1 на апикальных отростках (верхняя панель). Средняя панель показывает положение ядер клеток RPE (DAPI), а нижняя панель представляет собой наложенное изображение окрашивания ядер Kir7.1 и DAPI. Используемые сокращения: хориоидея (Ch), пигментный эпителий сетчатки (RPE), наружный ядерный слой (ONL), внутренний ядерный слой (INL), ганглиозный клеточный слой (GCL), фоторецепторы (PR), базальная сторона (ba) и апикальная сторона. сторона (ап).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071744.g001

Измененная функция человеческого канала Kir7.1R162W

Для сравнения биофизических свойств каналов дикого типа hKir7.1 и мутантных каналов R162W мы трансфицировали клетки плазмидами и регистрировали результирующий ток в режиме целых клеток. Репрезентативные текущие записи показаны на рис. 2. Когда клетки, экспрессирующие pEGFP-hKir7.1, подвергались воздействию импульсов ступенчатого напряжения различной амплитуды (от -150 до +50 мВ) длительностью 1300 мс при удерживающем потенциале -10 мВ, клетки реагировали с увеличением амплитуды тока строго в гиперполяризующем направлении.Как показано на рис. 2А (верхняя панель), только гиперполяризующие импульсы регистрировали большой внутренний ток. В репрезентативной клетке амплитуда тока составляла ~ 400 пА в ответ на импульс гиперполяризующего напряжения -150 мВ. Активация тока была мгновенной без какой-либо зависящей от времени десенсибилизации в течение длительности импульса напряжения, как и ожидается для каналов Kir7.1. Каналы Kir7.1 демонстрируют зависящее от напряжения снижение амплитуды исходящего тока [20], [21]. Внешний ток через hKir7.1 канал постоянно уменьшался по мере деполяризации клетки. Как отмечено на рисунке, амплитуда тока, измеренная при удерживающем потенциале -10 мВ, была положительной (обратите внимание на положительный ток как направленный наружу ток по сравнению с токовой линией, обозначенной пунктиром 0 на рис. 2А), и токовые отклики на импульс -70 мВ на рис. 2A, верхняя кривая выровнена с линией тока 0, что указывает на реверсивный потенциал канала. Используя протокол, аналогичный протоколу, описанному выше для pEGFP-hKir7.1, текущие следы, зарегистрированные в клетках, экспрессирующих плазмиду pmCherry-R162W, отличались от ожидаемых для Kir7.1 канал тока. Амплитуды тока, измеренные при -140 мВ, составляли менее 25% (~ 98 пА) от тока канала hKir7.1. Клетка реагировала на деполяризующие или гиперполяризующие ступенчатые потенциалы с одинаковыми амплитудами направленного наружу и внутрь тока соответственно (рис. 2А, нижняя панель). Эффективность трансфекции измеряли путем подсчета флуоресцентно-позитивных клеток и не выявили различий между клетками, экспрессирующими hKir7.1 GFP и R162W mCherry (36±6% против 33±8%).

Рисунок 2. Каналы Kir7.1 R162W отображают измененную функцию.

( A ) Репрезентативные записи, показывающие реакцию тока на импульсы напряжения продолжительностью 1,5 секунды. Гиперполяризующие потенциалы дают большие внутренние токи и небольшие внешние токи из-за канала hKir7.1 (верхняя панель), тогда как амплитуды направленного и внутреннего тока были одинаковыми для каналов R162W (нижняя панель). Горизонтальная пунктирная линия представляет линию нулевого тока. Протокол импульса напряжения указан на вставке. ( B ) Средняя амплитуда тока в зависимости отГрафик приложенного напряжения (ВАХ) для нетрансфицированных (NT-: заштрихованные треугольники), трансфицированных клеток pmCherry-R162W (R162W: незаштрихованные кружки) и pEGFP-hKir7.1 (hKir7.1: незаштрихованные квадраты). Ответы были усреднены по крайней мере из 5 экспериментов. ( C ) Нормализованные токи (I/I -150 мВ ), отражающие явный положительный сдвиг потенциала нулевого тока (квадрат-hKir7.1 и кружок-R162W). ( D ) График ВАХ для клеток, трансфицированных каналами hKir7.1, показывающий ток всей клетки (открытые квадраты) и ток в присутствии 20 мМ Cs + (открытый кружок).Ток Кира (закрашенные треугольники) представляет собой чувствительную составляющую Cs + , полученную путем математического вычитания (квадрат минус круг). ( E ) График I–V для клеток, трансфицированных pmCherry-R162W, с символами, как на D. Столбики ошибок представляют собой ± SEM.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071744.g002

Чтобы упростить сравнение текущей амплитуды от трансфицированных клеток (показано на рис. 2A), записи были усреднены для отображения графиков зависимости I-V.График ВАХ для клеток, трансфицированных hKir7.1 (рис. 2B, квадратная кривая), показал заметный внутренний выпрямляющий ток с небольшим выходным током, что представляет снижение наклонной проводимости в ответ на деполяризующие тестовые потенциалы. Средний ток, измеренный при -140 мВ, составил 391 ± 12 пА (n = 18) входящего тока. Средняя плотность тока составила 28,5±2 пА/пФ. Измеренная проводимость наклона составила 5,4 нСм для токов от -50 мВ до -130 мВ и 1,3 нСм для токов от -30 до +10 мВ. Этот внутренний выпрямляющий ток не был обнаружен в записях клеток, трансфицированных мутантом pmCherry-R162W (рис.2В, окружность).

Было замечено несколько существенных различий в текущих записях. Во-первых, амплитуда тока во всех клетках, экспрессирующих канал R162W, была небольшой. Входящий ток составил всего 133±64 пА при -140 мВ, что соответствует средней плотности тока 8,35±3 пА/пФ (n = 29). Этот ответ составлял всего 25% от амплитуды тока канала дикого типа и был лишь немного больше, чем в нетрансфицированных клетках (63±7 пА при -140 мВ, n = 5; рис. 2B, треугольная кривая). Измеренная проводимость наклона для мутантного канала равнялась 1.13 нСм для токов от -50 мВ до -130 мВ и 1 нСм для токов от -30 до +10 мВ. Во-вторых, график IV был омическим (прямая линия, пересекающая ноль на оси напряжения), как показано на рис. 2C, который представляет собой нормированный график тока и напряжения. Наконец, клетки, экспрессирующие канал R162W, были деполяризованы по сравнению с трансфицированными клетками дикого типа, что подтверждается графиком нормированного тока в зависимости от приложенного импульса напряжения (фиг. 2C). Клетки были деполяризованы примерно на 52 мВ от -64 ± 2.от 4 мВ (n = 9, hKir7.1) до –12±2,1 мВ (n = 29, R162W), p<0,005. Эти результаты показывают, что мутантный канал не функционирует так, как можно было бы ожидать для нормального Kir7.1.

Затем мы проверили влияние блокатора канала Kir7.1 (Cs + ) на функцию мутантного канала. На рис. 2D показано, что в растворе ванны 20 мМ Cs + как входящие, так и выходящие токи уменьшались до амплитуд, сходных с записями, полученными от нетрансфицированных клеток. Амплитуда тока уменьшилась с 391±12 до 53±10 пА (n = 7) при измерении при –150 мВ.Когда ток в присутствии Cs + был вычтен из значений предварительной обработки, результирующий график ВАХ (рис. 2D, треугольная кривая) чувствительного компонента Cs + не отличался от графика ВАХ до обработки (рис. , 2D, квадратная трасса). Этот результат согласуется со знанием того, что клетки CHO не экспрессируют нативные каналы Kir7.1 [12]. Тот же эксперимент, проведенный с использованием клеток, трансфицированных pmCherry-R162W, показал, что Cs + в ванне не оказывает существенного влияния на ток мутантного канала.Амплитуда тока, измеренная при -140 мВ, была лишь частично снижена со 133±64 пА до 109±31 пА (n = 5) при использовании ванны Cs + . В отличие от канала дикого типа, вычисленный чувствительный ток Cs + предполагает, что функция канала Kir 7.1 очень мала.

Мутантный канал не проявляет селективности в отношении Rb

+

Еще одной важной характеристикой каналов Kir7.1 является то, что, в отличие от других членов семейства Kir, каналы Kir7.1 демонстрируют большее предпочтение проводимости Rb + , чем K + [21].Поскольку ранее было показано, что мутантный клон крысы Kir7.1 (R162W) образует неселективные каналы [1], мы протестировали мутантный человеческий канал на селективность K + и Rb + (рис. 3). Как показано на рис. 3А, клетки, экспрессирующие канал pEGFP-hKir7.1, реагировали мощным входящим током в ответ на Rb + в ванне (рис. 3А). Амплитуда тока в ответ на импульс напряжения -140 мВ увеличилась с 391±12 пА в присутствии 5 мМ внеклеточного K + до 2247±601 пА в присутствии 135 мМ внеклеточного Rb + (n = 5) .Результаты с раствором ванны Rb + показали по крайней мере шестикратное увеличение наклонной проводимости входящего тока (от 5,4 до 33 нСм, рис. 3C), деполяризацию мембранного потенциала и существенное снижение амплитуды внешнего тока. ток. Применение высокого внеклеточного раствора К + (рис. 3А, треугольная кривая) приводило только к деполяризационному сдвигу мембранного потенциала. Небольшое снижение наклонной проводимости входящего тока (2,6 нСм для высоких К + против 2,6 нСм).Также было замечено 5,4 нС для 5 мМ K + ). Амплитуда тока, измеренная при -140 мВ с высоким внеклеточным K + , составила 601 ± 94 пА (n = 5). По сравнению с ответом канала дикого типа ни внеклеточный Rb + , ни K + не влияли на амплитуду тока из-за канала R162W (рис. 3B и 3C). В то время как Rb + вызывал в среднем шестикратное увеличение амплитуды тока при -140 мВ для канала hKir7.1, для канала R162W было зарегистрировано только 1,5-кратное увеличение.В клетках, трансфицированных pmCherry-R162W, Rb + увеличивал ток со 117 ± 57 до 186 ± 92 пА, в то время как внешнее высокое [K + ] не вызывало значительного увеличения тока (117 ± 57 пА в 5 мМ внешнего K + против 156 ± 73 пА в 135 мМ внешнего К + , p = 0,112) амплитуды. В целом не было существенной разницы между влиянием двух ионов (K + и Rb + ) на ток R162W.

Рис. 3. Rb + не влияет на Kir7.1 Р162В.

Усредненный график I–V клеток, трансфицированных pEGFP-hKir7.1 ( A ) и pmCherry-R162W ( B ). Записи были получены в HEPES Ringer’s (Ctrl: незакрашенный квадрат), 135 мМ внеклеточного K + (закрашенный треугольник) или 135 мМ внеклеточного Rb + (незакрашенный кружок). Каждая точка данных представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего по крайней мере 5 экспериментов. ( C ) Сравнение среднего кратного увеличения амплитуды тока из-за воздействия на клетки 135 мМ внешнего Rb + (серая полоса) или 135 мМ внешнего K + (белая полоса), измеренного при — 140 мВ.Столбики погрешностей ± SEM.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071744.g003

Коэкспрессия мутанта R162W с изменениями дикого типа Kir7.1 I

Kir7.1

Механизм наследования SVD является аутосомно-доминантным, предполагая, что коэкспрессия нормальных и мутантных субъединиц канала приводит к дисфункции канала Kir. Таким образом, мы котрансфицировали клетки CHO с равным соотношением дикого типа и мутантной плазмиды (по 1 мкг каждой на чашку 35 мм) и изучали электрофизиологический результат.Амплитуды тока показывали ступенчатое увеличение и уменьшение в ответ на деполяризующие и гиперполяризующие импульсные потенциалы тестового напряжения соответственно (рис. 4А). Средняя амплитуда тока при -140 мВ для котрансфицированных клеток составляла 260 ± 66 пА (n = 10), что значительно ниже, чем амплитуда тока, зарегистрированная для клеток, экспрессирующих каналы дикого типа (P<0,05). Стационарный график ток-напряжение для клеток, экспрессирующих оба клона, был линейным (фиг. 4B) со средним мембранным потенциалом покоя -40±4.2 мВ и продемонстрировал деполяризующий сдвиг на 24 мВ по сравнению с клетками, трансфицированными только клоном дикого типа.

Рис. 4. Мутация R162W влияет на функцию канала Kir7.1.

Токи вызывали в клетках, совместно трансфицированных равными количествами ДНК pEGFP-hKir7.1 и pmCherry-R162W, в течение 500 мс импульсов ступенчатого напряжения 20 мВ от -160 до +40 мВ. ( A ) Необработанные данные записей тока, показывающие, что отклики были одинаковой амплитуды как при «-ve», так и при «+ve» напряжениях.Пунктирная линия представляет нулевой ток. ( B ) Зависимость I-V от семи совместно трансфицированных клеток (сплошной треугольник) показывает линейный ответ. Для сравнения ответы канала hKir7.1 и R162W показаны сплошной и пунктирной линиями соответственно. Обратите внимание, что в текущих ответах отсутствовало исправление и что потенциал нулевого тока был промежуточным между потенциалом канала дикого типа и ответом мутантного канала. ( C ) Подавление тока Kir мутацией R162W иллюстрируется сравнением относительного предпочтения токовых ответов Rb + по сравнению с K + при -150 мВ ( I Rb + / K + : черная полоса) и измерение проводимости входящего тока в диапазоне от -50 до -130 мВ ( G : серая полоса).Представлены средние значения ± SEM по крайней мере из 5 экспериментов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071744.g004

Измерение плотности тока и тока Rb + также показало значительно сниженный ответ для котрансфицированных клеток по сравнению с трансфекцией канала дикого типа. (Р<0,001). Наклонная проводимость является точной мерой формы графика ВАХ. Измеренная проводимость с положительным наклоном составила 2,89 нСм, а измеренная проводимость с отрицательным наклоном — 2.07 нС для клеток дикого типа плюс мутантный канал, экспрессирующих клетки. Амплитуды тока, измеренные при -140 мВ в присутствии Rb + , High K + и Cs + , составляли 759 ± 302 пА, 414 ± 130 пА и 221 ± 86 пА соответственно. Среднее увеличение амплитуды тока было только в 3,1 раза для Rb + (n = 8, P<0,0005) и в 1,8 раза для высоких значений K + (P<0,5) по сравнению с клетками, экспрессирующими каналы дикого типа.

Мы измерили соотношение RB + к высокой чувствительности K + ( I RB + / I K + ) для определения Kir7.1 функциональный канал. Сравнение между диким типом или мутантом по отдельности и совместной трансфекцией показало значительные изменения в функции канала (черная полоса на рис. 4C, P<0,05). Аналогичным образом было обнаружено значительное снижение проводимости канала ( G ) (серая полоса на рис. 4C, P<0,05). При предполагаемой вероятности открытия канала Kir7.1, равной 0,45, и единичном токе, равном 0,312, общее количество функциональных каналов для клеток дикого типа было нормальным и составляло 2849, но мутантные клетки и клетки, экспрессирующие мутантные клетки дикого типа, были ниже и составляли 961. и 1674 канала соответственно.Эти результаты ясно указывают на то, что мутация SVD оказывает негативное влияние на функцию канала дикого типа. Такие эффекты согласуются с обнаружением аномальных фенотипов сетчатки у гетерозиготных носителей.

Влияние мутантного канала на функцию дикого типа может быть результатом аберрантной экспрессии или локализации белка. Мы провели вестерн-блот-анализ для оценки экспрессии белка. Каналы hKir7.1 дикого типа и мутантные каналы R162W трансфицировали в клетки CHO с использованием равных количеств ДНК (фиг.5). Уровни Kir7.1 были уравнены с β-актином, а затем все эксперименты были нормализованы к трансфекциям только Kir7.1 дикого типа, чтобы учесть фоновые интенсивности от блота к блоту. Клетки, экспрессирующие Kir7.1 R162W, показали снижение общего белка Kir7.1 на 70%. При совместной трансфекции как Kir7.1 дикого типа, так и мутанта R162W наблюдалось снижение общего растворимого Kir7.1 на 50% по сравнению с Kir7.1 дикого типа. Это предполагает, что могла иметь место значительная потеря канала дикого типа из-за олигомеризации с мутантными субъединицами, что могло повлиять на сборку функционального комплекса, который не прошел бы механизм контроля качества ER.Хотя совместная трансфекция плазмид дикого типа и R162W увеличивала общую растворимую белковую фракцию Kir7.1, это не корректировало электрофизиологию мутанта. Таким образом, мы предполагаем, что включение любых субъединиц R162W в тетрамер изменяет функцию канала Kir7.1.

Рис. 5. Экспрессия белков hKir7.1 и R162W в трансфицированных клетках CHO.

( A ) Вестерн-блот экстрактов трансфицированных клеток с антителом против Kir7.1, показывающий интенсивность белка Kir7.1 при 54 кДа.Контроль β-актина подтверждает, что на каждую дорожку загружали одинаковые количества белка. Указаны плазмиды, используемые для каждой трансфекции. ( B ) Общие уровни Kir7.1 нормализовали относительно β-актина. Средняя общая экспрессия растворимого белка Kir7.1 из трех различных трансфекций, использованных для электрофизиологических исследований, представлена ​​как отношение экспрессии белка к уровням белка hKir7.1 дикого типа.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071744.g005

Мембранная локализация мутантного канала Kir7.1

Потеря функции канального белка происходит при нарушении переноса белка к мембране. Чтобы определить, изменяет ли мутация SVD мембранную локализацию мутантного белка Kir7.1, мы определили относительную экспрессию флуоресценции соответствующего сигнала EGFP и mCherry. Для клеток, трансфицированных pEGFP-hKir7.1, флуоресценция GFP локализовалась совместно с клеточной мембраной (верхняя панель рис. 6A), и не было перекрытия ни с окрашиванием ER, ни с ядерным окрашиванием.Это показано на соответствующем графике линейного сканирования (рис. 6B (верхняя панель), где распределение Kir7.1 обнаружено на обоих концах линейного сканирования (черная кривая верхней панели рис. 6B) без наложения на ядерное ( синий) или сигнал ER (красный). На фиг. 6A (средняя панель) клетка, экспрессирующая pEGFP-R162W, не показывает зеленой флуоресценции на мембране, но показывает возможную локализацию мутантного белка в ER. График линейного сканирования (фиг. 6B, средняя панель), показывает сигнал GFP (зеленая кривая), перекрывающийся с распределением сигнала ER (красная кривая), но не с распределением ядер (синяя кривая).Только трансфекция GFP (рис. 6А, нижняя панель) показывает ожидаемое распределение зеленой флуоресценции по всей клетке, включая локализацию в ядре. Линейное сканирование изображений на рис. 6А дополнительно подтверждает локализацию белка дикого типа в мембране (черная кривая на нижней панели рис. 6В), локализацию мутантного белка в ЭР (светло-зеленая кривая на нижней панели рис. 6Е) и локализацию GFP внутри клетки ( Рис. 6Е (нижняя панель, темно-зеленый след). Расчет средней площади под кривой для pEGFP-hKir7.1 (1154176±56700 мкм 2 ) существенно не отличалась от таковой для pEGFP-R162W (1115493±79990 мкм 2 ), что указывает на сопоставимые уровни трансфекции. В клетках, совместно трансфицированных pEGFP-hKir7.1 и pmCherry-R162W, флуоресценция EGFP локализовалась в основном на периферии клетки, как и ожидалось, когда имеется мембранная локализация канала дикого типа (фиг. 6C). Напротив, флуоресценция mCherry преимущественно визуализировалась во внутриклеточных компартментах (рис. 6D) и была связана с разбросанным перинуклеарным паттерном экспрессии, согласующимся с распределением ER.Наложенные друг на друга изображения как зеленого, так и красного каналов дополнительно продемонстрировали, что существует отчетливая локализация канала дикого типа внутри мембраны, в отличие от более перинуклеарного распределения мутантного канала (Fig. 6E). Количественное измерение соотношений значений пикселей флуоресценции между мембранными и цитоплазматическими участками (рис. 6F) подтвердило значительно различающиеся модели распределения канала дикого типа по сравнению с мутантным каналом в котрансфицированных клетках (рис. 6F, P<0,05).

Рис. 6.Сотовая локализация канала Kir7.1.

Клетки CHO , экспрессирующие pEGFP-hKir7.1, pEGFP-R162W ( A ) или оба pEGFP-hKir7.1+ pmCherry-R162W ( C , D , E) Флуоресцентная микроскопия клеток с использованием иммерсионного объектива с увеличением 60X. Kir7.1 локализуется в основном на плазматической мембране ( A . верхняя панель, зеленая: hKir7.1, красная: ER и синяя: ядро) в клетках, трансфицированных pEGFP-hKir7.1. Экспрессия pEGFP-R162W, совместно локализованная с мечением ER ( A .средняя панель). Контрольные экспрессирующие pEGFP клетки показаны на нижней панели ( A ). ( B ) Линейные сканы (белая стрелка) распределения интенсивности флуоресценции pEGFP-hKir7.1 ( A . черная кривая верхняя панель), pEGFP-R162W ( A . зеленая кривая средняя панель) и pEGFP ( A . Темно-зеленый след (нижняя панель) трансфицированных клеток. Красные и синие кривые ( B . верхняя панель и средняя панель) представляют мечение ER и окрашивание ядер Hoechst соответственно.В экспериментах по совместной трансфекции флуоресценция GFP локализовалась на клеточной мембране ( C ), тогда как флуоресценция mCherry показывает внутриклеточную агрегированную локализацию ( D ). Наложение как красной, так и зеленой флуоресценции ( E ) дополнительно иллюстрирует очень небольшую совместную локализацию сигналов канала дикого типа и мутантного типа. ( F ) Количественная оценка флуоресценции мембраны по сравнению с цитоплазматической экспрессией из пяти независимых котрансфекций с pEGFP-hKir7.1 и плазмиды pmCherry-R162W показаны в F , p<0,01.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071744.g006

Моделирование гомологии Анализ эффекта замены Arg162 триптофаном

Для каналов Kir внеклеточный консервативный петлевой домен GYG участвует в качестве фильтра селективности [2], но недавно опубликованная структура белка Kirbac3 (бактериальный канал Kir) также поддерживает регулирующую роль в отношении селективности K + и проникновения цитоплазматического область [2], [22].В частности, С-концевая последовательность, непосредственно следующая за второй трансмембранной (TM2) последовательностью, имеет группу консервативных основных остатков, которые участвуют в электростатических взаимодействиях и обеспечивают гибкость в С-линкерном домене, который регулирует открытие и закрытие канала. 2]. Эти заряженные остатки находятся в непосредственной близости от внутреннего листка плазматической мембраны, где в изобилии находятся сайты связывания регуляторных молекул, таких как PIP 2 [23].

Недавно мы продемонстрировали, что взаимодействие PIP 2 с Kir7.1 канал является важной детерминантой функции клеток РПЭ [24]. На рис. 7 показаны трехмерные структурные модели Kir7.1 дикого типа и мутантного R162W на основе матриц Kir2.2 и Kir2.2R186A соответственно с использованием программы MODELLER [15]. Модели предполагают, что мутация R162W не нарушает общую укладку мономера белка или сборку тетрамера. Расположение R162 на поверхности мономера делает маловероятными нарушения фолдинга белка R162W.Аргинин и триптофан имеют схожие размеры, и как в нашей модели, так и в экспериментах положение их боковых цепей находится в пределах сайта связывания PIP 2 , а не на поверхности раздела мономер-мономер. Таким образом, маловероятно, что мутация R162W нарушит связь мономер-мономер.

Рис. 7. Модель Kir7.1 человека и гомология семейства каналов Kir в домене C-линкера.

( A ) Тетрамерная структурная модель белка Kir7.1 и четырех взаимодействующих молекул PIP 2 .Выделенная структура увеличена для ясности взаимодействия между горячей точкой С-конца и головной группой PIP 2 . ( B ) R162 взаимодействует с PIP 2 через 3 водородные связи, как показано зелеными пунктирными линиями. ( C ) Структура R162W с указанием остатка триптофана и ориентации его боковой цепи по отношению к PIP 2 . ( D ) Сравнение взаимодействия как R, так и W в положении 162 с PIP 2 (зеленая пунктирная линия), а также с соседней K-разделяющей водородной связью (фиолетовая пунктирная линия).( E ) Топология субъединицы Kir7.1, показывающая относительное положение С-линкера и остатка Arg (R) 162, расположенного рядом со 2-м трансмембранным доменом. ( F) Сохранившиеся основные остатки среди каналов Kir обозначены заглавными буквами. Мутации болезни выделены жирным шрифтом. Остатки в области С-линкера заштрихованы. Цифры обозначают первый и последний остатки в соответствующей последовательности. Виды, название и инвентарные номера белков, использованных для этого сравнения, были следующими: hKir1.1 NM_000220, hKir2.1 NM_010603, hKir2.2 GI: 23110982, hKir3.1 NM_002239, hKir4.1 NM_002241, hKir5.1 NM_018658, hKir7.1 NM_002242 и cKir2.2 GI: 80099 97 81800

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071744.g007

Замена триптофана приводит к удалению положительно заряженного остатка из активного сайта связывания PIP 2 . На рис. 7В показано, как расположение положительно заряженного аргинина позволяет множественные водородные связи с одной из фосфатных групп PIP 2 (зеленые пунктирные линии).Замена остатка триптофана удаляет эти полярные атомы азота из сайта связывания, делая его менее благоприятным для взаимодействия с PIP2 и более благоприятным для взаимодействия с липидной мембраной (Fig. 7C). Лизин в соседнем положении 164 может в некоторой степени компенсировать отсутствие аргинина, но с ослабленным взаимодействием (рис. 7D, красная пунктирная линия). Конечным результатом мутации R162W, по-видимому, является потеря сильных нековалентных взаимодействий с фосфатными группами Kir7.1-PIP 2 .

Наше моделирование гомологии поддерживает гипотезу о том, что R162W приводит к потере взаимодействия с PIP2 , , что приводит к потере функции канала. Для подтверждения этого результата необходимы дальнейшие исследования с использованием моделирования молекулярной динамики, особенно потому, что ароматические остатки могут взаимодействовать с липидными бислоями несколькими способами, которые влияют на сворачивание и ассоциацию [25], [26].

Обсуждение

ПЭС представляет собой поляризованный эпителий с отчетливой апикальной микроворсинчатой ​​структурой, взаимодействующей с наружными сегментами фоторецепторов.Экспрессия гена KCNJ13 в ПЭС в 19 раз превышает его экспрессию в фоторецепторах или сосудистой оболочке [27]. В соответствии с этим мы обнаружили, что белок Kir7.1 заметно локализован в апикальных структурах RPE. Мы не обнаружили белок Kir7.1 в других участках сетчатки [7], [28]. Мы подтвердили наши результаты, используя препараты сетчатки приматов, взрослых людей и эмбрионов человека. Хотя каналы Kir7.1 обнаружены и в других органах, включая мозг и почки [21], [29]–[32], функция Kir7.1 изучен только в клетках РПЭ [7], [16], [17], [20], [33], [34].

В этой статье мы показываем, что экспрессия человеческого канала Kir7.1 дикого типа в клетках CHO приводит к высокоселективному току, тогда как экспрессия человеческого мутантного Kir7.1 R162W приводит к линейной записи тока, клетки деполяризуются. , а амплитуда входящего тока существенно уменьшилась. Таким образом, мутантные каналы Kir7.1 человека нефункциональны в качестве гомотетрамера, но приводят к нефункциональным каналам, когда мутантные каналы включаются в гетеротетрамерную структуру с белком дикого типа.Ранее сообщалось о мутантном дисфункциональном канале с использованием крысиного клона Kir7.1, слитого с GFP, который образовывал неселективный протекающий канал, деполяризующий клетки [1]. Наши результаты нельзя отнести к измененной функции из-за конструкции слияния GFP, поскольку версии без слияния плазмиды Kir7.1 также привели к нефункциональному каналу для мутантного белка (рис. S1 в файле S1). Клон Kir7.1 крысы отличался от нашего клона человека наличием дополнительной мутации A139S, которая также обнаружена у крыс дикого типа [1].В нашем исследовании канал Kir7.1 человека не нес мутацию A139S, поэтому можно проанализировать любые дополнительные эффекты, связанные с этой мутацией. Мы также показали, что человеческий R162W мутантный канал Kir7.1 деполяризует потенциал покоящейся мембраны почти до нуля без предпочтения ни K + , ни Rb + . Эти результаты подтверждают влияние этой цитоплазматической мутации на возникновение нефункционального канала.

В то время как селективность канала Kir7.1 обычно обеспечивается селективной P-петлей, расположенной между двумя трансмембранными доменами на внешней клеточной мембране [2], его вход контролируется цитоплазматическими доменами.Необычная селективность Rb + канала Kir7.1 была приписана остатку метионина (M) в положении 125 в P-петле селективности, которая имеет консервативный аргинин (R) во всех других каналах Kir [29]. Для канала Kir1.1 мутация R128 в M приводит к пятикратному увеличению проводимости Rb + по сравнению с K + [35]. Поскольку остаток R162 Kir7.1 расположен рядом с цитоплазматическим листком, существует отдаленная вероятность того, что взаимодействие между последовательностью селективности и доменом R162 изменено этой мутацией, тем самым изменяя селективность Rb + и K + . а не из-за неработающего канала.

Последовательность цитоплазматического С-линкера регулирует функцию канала Kir7.1

Несколько недавних сообщений о структуре канала Kir указывают на возможную роль цитоплазматической последовательности С-линкера в определении селективности канала [14], [22]. R162W расположен в структуре C-линкера (фиг. 7E), которая консервативна среди каналов Kir (фиг. 7F). Наши результаты структурного моделирования показывают, что мутация R162W изменяет несколько Н-связей. Поскольку структуры С-линкера вносят вклад в гибкость структуры белка и помогают в скручивании и сжатии [14], [22], потеря гибкости из-за вставки неполярного триптофана создает жесткость в структуре, возможно. влияющие на контролируемое открытие и закрытие.

Нефункционирующий канал может быть результатом структурных изменений, влияющих на его передачу от аппарата Гольджи к плазматической мембране. В этом исследовании мы показали, что мутантный белок R162W не перемещается на мембрану. Для канала Kir2.1 последовательность переноса Гольджи в плазматическую мембрану связана с остатками с 242 по 246 [36]. Аргинин обладает двумя открытыми сайтами для N-метилирования, посттрансляционной модификации белка, которая, вероятно, способствует перемещению белка. Остаток триптофана в том же месте не будет иметь этой модификации.Zhang и коллеги недавно сообщили, что мутантный белок R162W нефункционален при использовании системы экспрессии ооцитов [18]. В исследовании Zhang мутантные каналы Kir7.1 успешно локализовались как в клеточной мембране ооцитов, так и в клеточной мембране Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), тогда как в нашей системе экспрессии млекопитающих этого не происходит. Одно из объяснений этой разницы в наших выводах заключается в том, что, хотя система ооцитов идеальна для изучения физиологии ионных каналов, она может быть неэффективной при изучении переноса каналов и транспортеров из-за разницы в температуре культуры [37].Исследования MDCK показали мутантные каналы с уменьшенной локализацией в мембране по сравнению с каналом дикого типа, при этом мутантные каналы ограничены частями поляризованной мембраны [18]. Локализация ER в клетках MDCK, если таковая имеется, неясна. Клетки MDCK представляют собой поляризованные эпителиальные клетки, которые используют исключительно механизмы сортировки для мембранной экспрессии белков. В клетках РПЭ каналы Kir7.1 присутствуют только в апикальной мембране. Направленный трафик каналов Kir7.1, вероятно, контролируется с помощью сигналов, расположенных в крайнем С-концевом домене, и еще предстоит выяснить, как этот домен взаимодействует с остатком R162 [11].В клетках MDCK такого поляризованного распределения каналов Kir7.1 не наблюдалось Zhang et. др. при трансфекции [18]. Это указывает на то, что перенос каналов в клетках MDCK происходит независимо от механизма клеточной сортировки. Наши результаты отличаются, потому что мы использовали зонды слияния флуоресценции в визуализации живых клеток, которые идеально подходят для биологической визуализации белков, таких как канал Kir7.1 в живых клетках, и менее подвержены экспериментальным артефактам. Кроме того, мы показали на культивируемых клетках RPE плода человека, что совместная трансфекция каналов дикого типа и мутантных каналов дала результаты, сопоставимые с результатами, обнаруженными в клетках CHO (рис. S2 в файле S1).Мы планируем определить точную локализацию мутантного белка в будущем исследовании с использованием многоаспектного подхода, включая биотинилирование клеточной поверхности, FRET и конфокальную микроскопию с вращающимся диском с использованием поляризованной клеточной культуры RPE.

Остаток 162 участвует в PIP

2 Регламент

Другая важная роль аргинина в положении 162 связана с взаимодействием с PIP 2 во внутреннем листке. Все каналы Kir активируются PIP 2 [23], [38], и один из сайтов связывания PIP 2 картируется в цитоплазматической горячей точке «bPbbb» (b-основной остаток и P-пролин), как показано на рисунке. на рис.7 (Д и Е) [39], [40]. Основной остаток в положении 162 консервативен во всех Kir-каналах и участвует как во взаимодействиях PIP 2 , так и в каналах (Fig. 7F). Как недавно было рассмотрено нашей группой и резюмировано на рис. 7F, мутации канала Kir в горячей точке были связаны с несколькими фенотипами заболевания [39]. PIP -2- регулирует функцию канала Kir7.1 в RPE [24], стабилизирует структуру Kir в мембране [14], а также помогает в посттрансляционной сборке и переносе канала на мембрану [41].

Kir-канал представляет собой тетрамерный белок, и молекулы PIP 2 взаимодействуют с сайтом связывания, соединяющим две соседние субъединицы [14], [42], [43]. Остается определить, как мутантные субъединицы могут быть включены в структуру тетрамерного белка. Для канала Kir2.1 было высказано предположение, что изменение одного сайта связывания PIP 2 изменяет функцию канала [42]. Наш анализ моделирования в этом исследовании основан на недавно решенной структуре белка Kir, включая молекулярные взаимодействия PIP 2 [14], [22].Чжан и др. др. недавно сделал вывод, что R162W изменяет взаимодействие канала Kir7.1-PIP 2 [18], но наши результаты предполагают физический механизм, с помощью которого это происходит. Вполне вероятно, что мутант R162W предотвращает связывание как PIP , так и , что затем может препятствовать трансляции цитоплазматического домена по направлению к мембране. Также основываясь на расположении R186 в Kir2.2, наша модель гомологии Kir7.1 предполагает, что R162W будет способствовать определению проводимости и селективности канала Kir, как сообщалось ранее [22].Моделирование гомологии, как здесь, однако, не предсказывает фактическое изменение взаимодействия боковой цепи аминокислоты с окружающей средой (растворителем и/или липидами). Будет интересно определить, приводят ли мутации в положении 162 в других членах семейства каналов Kir к нефункциональным и/или неселективным каналам.

Дефект Kir7.1 объясняет классический фенотип SVD

Различные клинические признаки СВД, в том числе отложения в виде снежинок, фокальная дегенерация РПЭ и умеренная миопия, могут быть результатом нефункциональной апикальной мембраны Kir7.1-канал, который приводит к изменению физиологии RPE. Проводимость Kir7.1 способствует гиперполяризованному апикальному мембранному потенциалу RPE, который способствует связи RPE/фоторецепторов [44], [45]. Блокирование функции канала Kir7.1 может деполяризовать апикальную мембрану RPE [24], [33], [34], [46], но также влияет на потенциал базальной мембраны [46]. В случае SVD деполяризация мембран RPE, о чем свидетельствует коэкспрессия каналов Kir7.1 дикого типа и мутанта, может влиять на взаимодействие фоторецептор-RPE и нарушать целостность эпителиального барьера, тем самым способствуя отложениям в виде снежинок. которые в конечном итоге связаны с дегенерацией РПЭ.

Миопический глаз характеризуется увеличенным осевым размером и большим объемом стекловидного тела. Crewther и коллеги продемонстрировали на курах, что каналы RPE Kir7.1 работают вместе с котранспортером апикальной мембраны NKCC, чтобы регулировать рефракционную компенсацию [47]. Ингибирование канала Kir7.1 Ba 2+ не компенсирует наложенную оптическую дефокусировку [47]. Это открытие подтверждает нашу гипотезу о том, что увеличение объема стекловидного тела является результатом снижения потока жидкости через RPE [48].Таким образом, как близорукость, так и жидкое стекловидное тело, обнаруженные у пациентов с СВД, могут возникать из-за изменений потока жидкости через ПЭС.

Субретинальный K

+ Гомеостаз вносит важный вклад в ERG

Мы предполагаем, что аномальная b-волна ЭРГ у пациентов с СВД связана с нарушением ионного окружения субретинального пространства, которое влияет на чистую пространственную буферизацию K + в сетчатке [49]. В субретинальном пространстве наблюдается вызванное светом снижение концентрации K + , которое частично гиперполяризует как клетки Мюллера, так и фоторецепторы.Падение субретинального пространства К + также деполяризует клетки РПЭ за счет изменения трансмембранного потенциала. В апикальной мембране RPE калий непрерывно рециркулирует с помощью Na + -K + -АТФазы, которая способствует поглощению K + , тогда как Kir7.1 способствует оттоку K + в субретинальную область. пространство. Одним из ключевых событий после воздействия света является высвобождение вещества светового пика из сетчатки, которое активирует рецептор, связанный с G-белком RPE (GPCR).Поскольку каналы Kir7.1 активируются PIP 2 , активация индуцированного светом GPCR будет ингибировать канал Kir7.1 и приводить к деполяризации апикальной мембраны RPE. Впоследствии происходит повторный синтез PIP 2 , чтобы обеспечить повторное открытие каналов Kir для реактивации каналов и восстановления субретинального пространства K + до уровней покоя. Мутант Kir7.1 нефункционален и, следовательно, не реагирует на нормальные световые регуляции. Волна b возникает, по крайней мере частично, из-за деполяризации on-биполярных клеток, которая возникает в ответ на индуцированное светом снижение высвобождения глутамата из фоторецепторов.Ожидаются грубые изменения мембранного потенциала покоя как фоторецепторов, так и клеток Мюллера из-за изменений в механизмах гомеостаза субретинального пространства K + , и, вероятно, они способствуют аномалии b-волны, наблюдаемой у пациентов с SVD.

Таким образом, мы показали, что мутация Kir7.1 R162W, связанная с SVD, образует нефункциональный канал при экспрессии в гетерологичной системе. Поскольку канал Kir7.1 является тетрамерным, основной механизм заболевания, вероятно, является результатом включения мутантных субъединиц в процесс сборки, которые изменяют структуру и функцию получающегося в результате канала.Мутации Kir7.1 также были связаны с врожденным амаврозом Лебера (LCA), что вместе с результатами SVD предполагает, что этот ионный канал играет важную роль в заболеваниях глаз [50] и, экстраполируя, в заболеваниях, связанных с другими органами. системы, в которых каналы Kir7.1 могут влиять на функцию ткани [51].

Благодарности

Мы благодарим Б. Хьюза, доктора философии, Мичиганский университет, за подарок антитела Kir7.1 и полезное обсуждение этого проекта.Мы благодарим Гейл Робертсон, доктора философии, Университет Вашингтона, Мэдисон, за советы и критические комментарии к этой рукописи. Мы благодарим Wenxiang Luo, PhD, UW-Madison, за техническую помощь.

Авторские взносы

Задумал и спроектировал эксперименты: BRP ST DMP. Выполнены опыты: БРП СТ МПА ТС СКМ. Проанализированы данные: BRP ST MPA JCM DMP. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты анализа: BRP AS AOE DMP. Написал статью: BRP JCM AOE DMP.

Каталожные номера

  1. 1. Hejtmancik JF, Jiao X, Li A, Sergeev YV, Ding X, et al.(2008) Мутации в KCNJ13 вызывают аутосомно-доминантную витреоретинальную дегенерацию снежинки. Am J Hum Genet 82: 174–180.
  2. 2. Хибино Х., Инанобе А., Фурутани К., Мураками С., Финдли И. и др. (2010) Внутреннее выпрямление калиевых каналов: их структура, функция и физиологическая роль. Physiol Rev 90: 291–366.
  3. 3. Дерст С., Доринг Ф., Прейзиг-Мюллер Р., Даут Дж., Карщин А. и др. (1998) Частичная структура гена и назначение на хромосому 2q37 внутреннего ректифицирующего К+ канала человека (Kir7.1) ген (KCNJ13). Геномика 54: 560–563.
  4. 4. Эдвардс А.О. (2008)Клинические особенности врожденных витреоретинопатий. Глаз (Лонд) 22: 1233–1242.
  5. 5. Ли М.М., Риттер Р. (2003)Витреоретинальная дегенерация снежинки: продолжение исходного семейства. Офтальмология 110: 2418–2426.
  6. 6. Виммерс С., Карл М.О., Штраус О. (2007)Ионные каналы в RPE. Prog Retin Eye Res 26: 263–301.
  7. 7. Ян Д., Пан А., Сваминатан А., Кумар Г., Хьюз Б.А. (2003)Экспрессия и локализация внутреннего выпрямляющего калиевого канала Kir7.1 в нативном пигментном эпителии сетчатки крупного рогатого скота. Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 3178–3185.
  8. 8. Strauss O (2009) [Роль пигментного эпителия сетчатки в зрительных функциях]. Офтальмолог 106: 299–304.
  9. 9. Штраус О (2005) Пигментный эпителий сетчатки в зрительной функции. Physiol Rev 85: 845–881.
  10. 10. Marmor MFaW, редактор TJ (1998) Транспортные механизмы в пигментном эпителии сетчатки: Oxford University Press. 103–134 стр.
  11. 11.Tateno T, Nakamura N, Hirata Y, Hirose S (2006)Роль C-конца калиевого канала Kir7.1 в экспрессии на клеточной поверхности. Cell Biol Int 30: 270–277.
  12. 12. Гампер Н., Стоканд Дж. Д., Шапиро М. С. (2005) Использование клеток яичника китайского хомяка (CHO) в исследовании ионных каналов. J Pharmacol Toxicol Methods 51: 177–185.
  13. 13. Thomas P, Smart TG (2005)Линия клеток HEK293: средство для экспрессии рекомбинантных белков. J Pharmacol Toxicol Methods 51: 187–200.
  14. 14. Хансен С.Б., Тао X, Маккиннон Р. (2011)Структурная основа активации PIP2 классического внутреннего выпрямителя K+ канала Kir2.2. Природа 477: 495–498.
  15. 15. Эсвар Н., Эрамиан Д., Уэбб Б., Шен М.Ю., Сали А. (2008) Моделирование структуры белка с помощью MODELLER. Методы Мол Биол 426: 145–159.
  16. 16. Кусака С., Инанобе А., Фудзита А., Макино Ю., Танемото М. и др. (2001) Функциональные каналы Kir7.1, локализованные в корне апикальных отростков в пигментном эпителии сетчатки крысы.J Physiol 531: 27–36.
  17. 17. Shimura M, Yuan Y, Chang JT, Zhang S, Campochiaro PA, et al. (2001)Экспрессия и свойства проникновения K(+) канала Kir7.1 в пигментном эпителии сетчатки. J Physiol 531: 329–346.
  18. 18. Чжан В., Чжан С., Ван Х., Шарма А.К., Эдвардс А.О. и др. (2013) Характеристика мутации R162W Kir7.1, связанной с витреоретинопатией снежинки. Am J Physiol Cell Physiol 304: C440–449.
  19. 19. Yang D, Zhang X, Hughes BA (2008)Экспрессия внутренне ректифицирующих субъединиц калиевых каналов в нативном пигментном эпителии сетчатки человека.Exp Eye Res 87: 176–183.
  20. 20. Хьюз Б.А., Такахира М. (1996)Внутреннее выпрямление токов К+ в изолированных клетках пигментного эпителия сетчатки человека. Invest Ophthalmol Vis Sci 37: 1125–1139.
  21. 21. Доринг Ф., Дерст С., Вишмейер Э., Каршин С., Шнеггенбургер Р. и др. (1998) Эпителиальный внутренний выпрямляющий канал Kir7.1 демонстрирует необычные свойства проникновения K+. J Neurosci 18: 8625–8636.
  22. 22. Кларк О.Б., Капуто А.Т., Хилл А.П., Ванденберг Д.И., Смит Б.Дж. и др.(2010)Переориентация домена и вращение внутриклеточной сборки регулируют проводимость в калиевых каналах Kir. Ячейка 141: 1018–1029.
  23. 23. Logothetis DE, Jin T, Lupyan D, Rosenhouse-Dantsker A (2007)Фосфоинозитид-опосредованная блокировка внутренних выпрямляющих K (+) каналов. Арка Пфлюгера 455: 83–95.
  24. 24. Pattnaik BR, Hughes BA (2009)Регулирование каналов Kir в клетках пигментного эпителия сетчатки крупного рогатого скота с помощью фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата. Am J Physiol Cell Physiol 297: C1001–1011.
  25. 25. Чжан В., Крокер Э., Маклафлин С., Смит С.О. (2003)Связывание пептидов с основными и ароматическими остатками с двухслойными мембранами: фенилаланин в эффекторном домене миристоилированного субстрата киназы C, богатого аланином, проникает в гидрофобное ядро ​​​​двухслойного. J Biol Chem 278: 21459–21466.
  26. 26. Санчес К.М., Канг Г., Ву Б., Ким Дж. Э. (2011)Взаимодействия триптофан-липид в фолдинге мембранных белков, исследованные с помощью ультрафиолетового резонансного комбинационного рассеяния и флуоресцентной спектроскопии.Биофиз J 100: 2121–2130.
  27. 27. Booij JC, ten Brink JB, Swagemakers SM, Verkerk AJ, Essing AH и др. (2010)Новая стратегия для выявления и аннотирования экспрессии генов, специфичных для RPE человека. PLoS One 5: e9341.
  28. 28. Yang D, Swaminathan A, Zhang X, Hughes BA (2008)Экспрессия Kir7.1 и новый вариант сплайсинга Kir7.1 в нативном пигментном эпителии сетчатки человека. Exp Eye Res 86: 81–91.
  29. 29. Крапивинский Г., Медина И., Энг Л., Крапивинский Л., Ян Ю. и др.(1998) Новый внутренний выпрямительный канал K+ с уникальными свойствами пор. Нейрон 20: 995–1005.
  30. 30. Дерст С., Хирш Дж. Р., Прейзиг-Мюллер Р., Вишмейер Э., Карщин А. и др. (2001)Клеточная локализация калиевого канала Kir7.1 в почках морской свинки и человека. Kidney Int 59: 2197–2205.
  31. 31. Schittenhelm J, Roser F, Tatagiba M, Beschorner R (2012)Диагностическая ценность EAAT-1 и Kir7.1 для различения опухолей эндолимфатического мешка от опухолей сосудистого сплетения.Ам Дж. Клин Патол 138: 85–89.
  32. 32. Ооката К., Тодзё А., Судзуки Ю., Накамура Н., Кимура К. и др. (2000)Локализация внутреннего выпрямляющего калиевого канала Kir7.1 в базолатеральной мембране дистального отдела нефрона и собирательных трубочек. J Am Soc Nephrol 11: 1987–1994.
  33. 33. Хьюз Б.А., Шейх А., Ахмад А. (1995)Влияние Ba2+ и Cs+ на проводимость апикальной мембраны K+ в пигментном эпителии сетчатки жаб. Am J Physiol 268: C1164–1172.
  34. 34. Хьюз Б.А., Такахира М. (1998)АТФ-зависимая регуляция внутреннего выпрямления тока К+ в клетках пигментного эпителия сетчатки крупного рогатого скота.Am J Physiol 275: C1372–1383.
  35. 35. Сакин Х., Наназашвили М., Ли Х., Палмер Л.Г., Уолтерс Д.Е. (2010)Консервированный аргинин рядом с фильтром Kir1.1 контролирует селективность Rb/K. Каналы 4: 203–214.
  36. 36. Hofherr A, Fakler B, Klocker N (2005)Селективный экспорт по Гольджи Kir2.1 контролирует стехиометрию функциональных гетеромеров канала Kir2.x. J Cell Sci 118: 1935–1943.
  37. 37. Ледук-Надо А., Люссье Ю., Артюс М.Ф., Лонерган М., Мартинес-Агуайо А. и др.(2010) Новые аутосомно-рецессивные мутации в аквапорине-2, вызывающие нефрогенный несахарный диабет из-за недостаточного нацеливания, демонстрируют нормальную экспрессию в ооцитах Xenopus. J Physiol 588: 2205–2218.
  38. 38. Suh BC, Hille B (2008) PIP2 является необходимым кофактором для функции ионного канала: как и почему? Энн Рев Биофиз 37: 175–195.
  39. 39. Паттнаик Б.Р., Асума М.П., ​​Спотт Р., Пиллерс Д.А. (2012)Генетические дефекты в очаге внутреннего выпрямления каналов K(+) (Kir) и их метаболические последствия: обзор.Мол Жене Метабол 105: 64–72.
  40. 40. Logothetis DE, Lupyan D, Rosenhouse-Dantsker A (2007) Разнообразные модуляторы Kir действуют в непосредственной близости от остатков, участвующих в связывании фосфоинозитидов. J Physiol 582: 953–965.
  41. 41. Маклафлин С., Ван Дж., Гамбхир А., Мюррей Д. (2002) PIP(2) и белки: взаимодействие, организация и поток информации. Ann Rev Biophys Biomol Struc 31: 151–175.
  42. 42. Xie LH, John SA, Ribalet B, Weiss JN (2008)Регулирование фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (PIP2) сильного внутреннего выпрямителя Kir2.1 канал: многоуровневое позитивное сотрудничество. J Physiol 586: 1833–1848.
  43. 43. Stansfeld PJ, Hopkinson R, Ashcroft FM, Sansom MS (2009) Сайт связывания PIP(2) в каналах Kir: определение с помощью многомасштабного биомолекулярного моделирования. Биохимия 48: 10926–10933.
  44. 44. Галлемор Р., Хьюз Б. и Миллер С. (1998) Световые реакции пигментного эпителия сетчатки. В: Marmor MF и Wolfensberger, TJ, редактор. Пигментный эпителий сетчатки. Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета.
  45. 45. Хьюз Б., Галлемор Р. и Миллер С. (1998) Транспортные механизмы в пигментном эпителии сетчатки; Мармор М.Ф. и Вольфенсбергер Т.Дж., изд. Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета.
  46. 46. Wang FE, Zhang C, Maminishkis A, Dong L, Zhi C, et al. (2010) МикроРНК-204/211 изменяет физиологию эпителия. FASEB J 24: 1552–1571.
  47. 47. Crewther SG, Murphy MJ, Crewther DP (2008)Участие калиевого канала и котранспортера NKCC в механизмах контроля рефракции глаза.PLoS One 3: e2839.
  48. 48. Crewther DP (2000)Роль фоторецепторов в контроле рефракционного состояния. Prog Retin Eye Res 19: 421–457.
  49. 49. Kofuji P, Newman EA (2004)Буферизация калия в центральной нервной системе. Неврология 129: 1045–1056.
  50. 50. Sergouniotis PI, Davidson AE, Mackay DS, Li Z, Yang X, et al. (2011) Рецессивные мутации в KCNJ13, кодирующие внутреннюю выпрямляющую субъединицу калиевого канала, вызывают врожденный амавроз Лебера.Am J Hum Genet 89: 183–190.
  51. 51. Накамура Н., Судзуки Ю., Сакута Х., Ооката К., Кавахара К. и др. (1999) Внутренний ректифицирующий K+-канал Kir7.1 в высокой степени экспрессируется в фолликулярных клетках щитовидной железы, эпителиальных клетках кишечника и эпителиальных клетках сосудистого сплетения: следствие функционального соединения с Na+,K+-АТФазой. Биохим J 342: 329–336.
.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.