Мелкая дробь: Самая мелкая дробь, 5 (пять) букв

Содержание

%d0%bc%d0%b5%d0%bb%d0%ba%d0%b0%d1%8f%20%d0%b4%d1%80%d0%be%d0%b1%d1%8c — с русского на все языки

Все языкиРусскийАнглийскийИспанский────────Айнский языкАканАлбанскийАлтайскийАрабскийАрагонскийАрмянскийАрумынскийАстурийскийАфрикаансБагобоБаскскийБашкирскийБелорусскийБолгарскийБурятскийВаллийскийВарайскийВенгерскийВепсскийВерхнелужицкийВьетнамскийГаитянскийГреческийГрузинскийГуараниГэльскийДатскийДолганскийДревнерусский языкИвритИдишИнгушскийИндонезийскийИнупиакИрландскийИсландскийИтальянскийЙорубаКазахскийКарачаевскийКаталанскийКвеньяКечуаКиргизскийКитайскийКлингонскийКомиКомиКорейскийКриКрымскотатарскийКумыкскийКурдскийКхмерскийЛатинскийЛатышскийЛингалаЛитовскийЛюксембургскийМайяМакедонскийМалайскийМаньчжурскийМаориМарийскийМикенскийМокшанскийМонгольскийНауатльНемецкийНидерландскийНогайскийНорвежскийОрокскийОсетинскийОсманскийПалиПапьяментоПенджабскийПерсидскийПольскийПортугальскийРумынский, МолдавскийСанскритСеверносаамскийСербскийСефардскийСилезскийСловацкийСловенскийСуахилиТагальскийТаджикскийТайскийТатарскийТвиТибетскийТофаларскийТувинскийТурецкийТуркменскийУдмурдскийУзбекскийУйгурскийУкраинскийУрдуУрумскийФарерскийФинскийФранцузскийХиндиХорватскийЦерковнославянский (Старославянский)ЧеркесскийЧерокиЧеченскийЧешскийЧувашскийШайенскогоШведскийШорскийШумерскийЭвенкийскийЭльзасскийЭрзянскийЭсперантоЭстонскийЮпийскийЯкутскийЯпонский

 

Все языкиРусскийАнглийскийИспанский────────АлтайскийАрабскийАрмянскийБаскскийБашкирскийБелорусскийВенгерскийВепсскийВодскийГреческийДатскийИвритИдишИжорскийИнгушскийИндонезийскийИсландскийИтальянскийКазахскийКарачаевскийКитайскийКорейскийКрымскотатарскийКумыкскийЛатинскийЛатышскийЛитовскийМарийскийМокшанскийМонгольскийНемецкийНидерландскийНорвежскийОсетинскийПерсидскийПольскийПортугальскийСловацкийСловенскийСуахилиТаджикскийТайскийТатарскийТурецкийТуркменскийУдмурдскийУзбекскийУйгурскийУкраинскийУрумскийФинскийФранцузскийЦерковнославянский (Старославянский)ЧеченскийЧешскийЧувашскийШведскийШорскийЭвенкийскийЭрзянскийЭсперантоЭстонскийЯкутскийЯпонский

Литье мелкой дроби — Заметки стрелка-юриста — ЖЖ

Братцы! Я не сторонник перепоста, но тема сия люто, бешено актуальная. При цене дроби в 70-90 грн., что нифига не гуманно, для счастливых обладателей гаража и двора это спасение. Для меня — соблазн и повод кооперироваться с обладателями гаража и двора.

Давно собирался написать пост про технологию литья дроби в кустарных условиях, да все как-то руки не доходили. Теперь, так сказать, в догонку к литью алюминия.

Маленькое лирическое отступление:  делать релоадинг патронов покупной дробью — это мазохизм, извращение и пустая трата денег. Ибо самое дорогое в патроне — это навеска. И если пули или дробь для релоада покупать в магазине, то лучше брать сразу готовые патроны — дешевле выйдет. Я не рассматриваю ситуацию банального отсутствия ормага в радиусе 500 километров — тогда можно и покупной дробью снаряжать.

Про литье пуль и картечи я уже писал ранее. Теперь про дробь. И так задача: отлить мелкую (№ 7..9) дробь, желательно более-менее круглую (не требующую дальнейшей обкатки) и как можно более простым способом. Простой способ — это значит без всяких хитрых и требующих тонких настроек приспособлений — как говориться «на коленке». Раньше я уже отливал дробь в воду с использованием полочки, которая была покрыта стеклотканью и смачивалась машинным маслом. Процесс был медленным и требовал долгой настройки и постоянного контроля процесса.

В последний раз я лил дробь в отработку. Отработка — отработанной моторное масло. Т.к. я работаю на автосервисе, то этого добра у меня как грязи.

И так: весь процесс по порядку:


Берем наконечники от старых шариковых ручек, коих можно набрать гору в любом офисе или даже порывшись в письменном столе у своего ребенка:

Отбираем у жены старую алюминиевую сковородку (в замен, естественно, дарим новую ну или хотя бы обещаем подарить):

Берем старый 1500 Вт тэн от электроплитки (меньшей мощности не хватит):

Это он такой красный не потому, что горячий — это он такой ржавый.

Прикидываем его к днищу сковородки:

Обводим контур (ну прям инь и ян получаются):

Сверлим отверстия по диаметру наконечников шариковых ручек:

Втыкаем наконечники:

После того, как наконечники будут установлены в отверстия в днище сковородки, из них надо аккуратно иголочкой с обратной стороны выдавить шарики:

Болтами прикручиваем тэн к днищу сковородки:

Сверху дно сковородки теперь имеет маленькие дырочки:

Инструмент подготовили, теперь готовим рабочее место.
Берем посуду, в которую будем лить дробь. Я взял 10 литровую канистру от растворителя, с которой срезал верхнюю крышку:

Далее устанавливаем посудину в такое место, где это будет пожаробезопасно и куда не страшно будет, если масло прольется.
Я поставил прямо в уличную печку:

На три четверти наливаем воды, на воду наливаем отработку:

Устанавливам сковородку с тэном:

В сковородку кладем свинец, на тэн подаем 220 В :

Да, контакты не изолированы. Да, нарушение ТБ при работе с электроприборами. А не надо туда пальцы совать и все будет ок.

По мере плавления свинца подкладывваем новые порции:

Процесс пошел:

Высоту падения капель я ни как не контролирую — как упадут так и будет.

По мере расходования свинца добавляем новые порции:

По мере наполнения емкости дробью уровень масла повышается. Лишнее масло просто переливается через край:

Вот так выглядит свежеотлитая дробь (просто ложку в масло опустил):

Часть дробинок с хвостиками, часть — практически идеально округлой формы:

В какой-то момент нагретое масло начинает гореть. Ничего страшного в этом нет. Наоборот: как только масло загорелось, можно отключать тэн от розетки. Теперь свинец будет плавится уже от горящего масла и даже быстрее, чем от тэна:

Здесь главное помнить: ГОРЯЩЕЕ МАСЛО НИ В КОЕМ СЛУЧАЕ НЕЛЬЗЯ ТУШИТЬ ВОДОЙ !!!  ТОЛЬКО НАКИДЫВАНИЕМ КУСКА ПЛОТНОЙ ТКАНИ !!!

После того, как весь свинец переплавлен или как все масло выгорело — что наступит быстрее (у меня закончился приготовленный свинец и я просто затушил масло, накинув сверху старое одеяло), сливаем из емкости остатки масла и воды. На дне полученная дробь:

Получилось примерно 12 кг дроби:

Далее через воронку переливаем полученную смесь из дроби и остатков масла в подходящую канистру и в несколько заходов моем дробь. Моем каким-нибудь самым дешевым моющим средством для посуды:

После промывки дробь надо рассыпать в какой-нибудь широкий поддои и на солнышко сушиться, периодически помешивая.

Все выше описанное я проделал еще прошлым летом. Отлитая дробь больше полу года простояла в ведерке под верстаком.
И на прошлых выходных у меня дошли руки ее отсепарировать. Т.е. разделить по номерам.
Дробь в ведерке:

Достал с чердака свой самодельный сепаратор дроби (уже когда-то делал пост про него), смахнул с него пыль, загрузил в бункер дробь и понесласть:

Левые две банки — это 9-ка и мельче. Далее две банки — 7-ка+9-ка. Самая правая банка — все, что не провалилось в предыдущие.
Процесс приходится прогонять по нескольку раз.

В результате получаем разделенную дробь:
— 9-ка и мельче
— 7-ка с небольшой примесью более мелкой (основная доля полученной дроби)
— 5-ка, 3-ка

Это 7-ка:

9-ка:

9-ка:

Вот, что получилось в итоге:

Наибольшая часть отлитой дроби — это 7-ка. Ну я в основном 7-кой и снаряжаю, для стрельбища — в самый раз.

5-ка, 3-ка:

Вот и всё.

Применение мелкой дроби — статья на сайте ГК Охотник

01. 07.2018

Эта статья во многом по мотивам темы «Шальная идея, или Стрельба мелкой дробью» на форумах guns.ru в ветке «Гладкоствольное оружие». Несколько участников её я знаю, даже охотились вместе.

Разговор в теме идёт о возможностях мелкой (от номера 7 и мельче) дроби на разных охотах, дистанциях и объектах. А я много лет уже применяю для большинства охот мелкую дробь, причём не просто мелкую, а спортивные патроны «Спортинг» 28 г 7,5. Это тетерев, куропатка, вальдшнеп, вяхирь, иногда в конце сезона — фазан. Приходилось неоднократно брать «Спортингом» глухарей в сентябре-октябре на ходовой охоте, крупных серых гусей, зайцев до снега, один раз даже молодую лису метров на 25. Всё это были чисто битые трофеи. Но основная дичь, которую я сознательно стреляю практически только «спортом», — это утка (оговорюсь, правда, эго либо стрельба с подъёма, либо с чучелами, но очень редко далее 30 метров). Но поскольку впереди весенняя охота, то и говорить будем о применении спортивного патрона с дробью 7,5 именно по весенним селезням.

Если б в начале 2000-х годов кто-то мне сказал, что патроном «для тарелочек» можно добывать не только у гку, но и гуся, я бы не поверил. Тем более бы не поверил, что я сам буду этим «заниматься». Не гусями, конечно, хотя и гут от «нолей» все мои друзья давно скатились к 2-3, а гусей все тем же «Спортингом» на вечерних тягах на компанию добыто уже больше десятка. Но это особые условия пролёт над болотом на высоте 15-20 метров. А вот весной по селезням патроны «Спортинг» уже больше десяти лет являются в нашей компании (в основном это или спортсмены-спор- тингисты, или, так сказать, «сочувствующие») основным боеприпасом. Почему? Ответ очень прост: они наиболее эффективны для стрельбы по сидячим селезням, а также гарантированно убивают птицу влёт (напомню, что Правила охоты сейчас не запрещают стрелять селезней влёт при охоте с подсадной или чучелом и манком). Есть и другие специфические плюсы, но о них позже.

Итак, по порядку. Что такое современный спортивный патрон 12-го калибра с дробью 7,5 28 г? Во-первых, это качество дроби, которое гораздо выше советских стандартов ГОСТ «лот» («литая охотничья твёрдая» — не менее 12 единиц). Твёрдость спортивной дроби при высоком качестве геометрии (сферичности формы) достигает 22 единиц. Это позволяет разогнать её до высоких скоростей с деформацией меньшей, чем аналогичные охотничьи дроби. Даже если это дробь 5-6 с твёрдостью (тоже высокой) 13-15, качество дробовой осыпи на дистанции у «Спортинга» будет выше: за счёт меньшего процента сплющенных при разгоне дробин будет лучше равномерность осыпи и кучность (в %). Как раз эти два параметра в основном определяют эффективность выстрела «Спортингом» на воде, т. е. по сидячей птице. Давно известно, что если утка плывёт, то чисто добыть её проще, если вспугнуть и выстрелить влёт. Это если применять классические номера дроби — «пятёрку». Дело в том, что у птицы на воде тем труднее поразить жизненно важные органы, чем меньше угол выстрела к поверхност и. Сердце находится ниже ватерлинии, а лёгкие хоть и частично выше, но прикрыты в несколько слоёв жёстким оперением крыла. Остаются голова и шея, и вот тут-то «пятёрка» на расстоянии далее 20 метров при стрельбе с «обычного» получека с кучностью 55% уже даёт окна, исключающие надёжное поражение головы и шеи крякового селезня, не говоря уже о более мелких породах.

Вместе с тем давно подмечено, что стандартная стендовая тарелка диаметром 11 см и высотой 3 см даже при стрельбе патронами 24 г надёжно разбивается «в ребро» до 30 м из сужений, по крайней мере, от 0,4 — это по собственному опыту. Для того чтобы тарелка, летящая со средней, невысокой скоростью 20 м/с, разбилась, в неё должно попасть 3-4 дробины. И не в край, а под углом до 60°. Иначе на мишени чаще всего будет просто скол. В этом легко убедиться, настроив машинку так, чтобы непоражённые тарелки падали куда-нибудь на мягкое — в траву или на снег. К чему это всё? Да к тому, что площадь убойной зоны головы и шеи даже чирка не сильно меньше площади «убойной» зоны стандартной стендовой тарелки в ребро. Только чирку, в отличие от тарелки, достаточно одной дробины.

На самом деле все эти «выкладки» — это уже следствие многолетнего опыта охоты «Спортингом», а не «смелая теория, требующая подтверждения практикой». Практики этой уже предостаточно. А подвести под неё «теоретический базис» заставила как раз та самая тема в «Гладстволе» на «Ганзе»: единомышленников по поводу мелкой дроби и «Спортинга» в частности оказалось больше, чем можно было бы предположить.

Всё-таки, о чём бы ни рыдали всякие «хранители традиций», культура охоты у нас повышается хотя бы в этом, и то хорошо.

Теперь о том, какие патроны «Спортинг» лучше всего показали себя именно на охотах. Тут есть нюансы, особенно для тех, кто уверенно стреляет на дистанции средние и дальше, от 30 метров. В интернете есть одно очень показательное видео многократного чемпиона мира по спортингу сэра Джорджа Дигвида (он, кроме того что великий стрелок, ещё и очень хороший охотник), где он наглядно показывает разницу в выстреле при разных температурах патрона. Тестировалось это всё по голубям (вяхирям) на дальние дистанции. Одна партия патронов была привезена в сумке-термосе при комнатной температуре и влажности, вторая долго находилась в уличных условиях. Визуально разница — только в чистоте стволов после выстрела. «Холодные» патроны (несмотря на то что это были очень качественные патроны на хорошем порохе) оставляли в стволах «пыль» от несгоревшего пороха, «комнатные» — практически идеально чистые стволы.

Так вроде бы ерунда — на это обычно и внимания не обращаешь. Вот только на расстояниях от 50 метров разница в «комнатных» и «холодных» патронах выражалась в том, что от первых голуби падали сразу, а при попадании «холодным» (это видно на камере) из них летели перья и пух, но сами птицы улетали порой метров за 100 и только там падали. В чём дело? Почему? Оказывается, даже при температуре около 5 °С и большой влажности начальная скорость дроби может упасть метров на 10-20 в секунду. И этой «малости» уже достаточно, чтобы на «рабочих» дистанциях заряд перестал надёжно поражать дичь. Это при использовании нормальных современных порохов, а не таких, как «Кемира», которая при подобных условиях могла дать разницу вдвое-втрое большую. По-моему, это главный и чуть не единственный минус дроби 7 и 7,5: дистанция её убойности при нормальном качественном патроне лежит в пределах осмысленного дальнего выстрела, тогда как у дроби 5 и даже 6 это расстояние уже ощутимо дальше, и есть некий запас по начальной скорости.
Т. е. стреляя «пятёркой», вы на охоте вряд ли ощутите большую разницу по действию на дичь V0,5 390 или 370 м/с. А вот «семёркой» во втором случае на расстоянии далее 30 метров уже либо могут быть подранки, либо, как в описанном выше видео, дичь будет отлетать и падать далеко.    

Дальше вопрос: как быть? Может, спортивные патроны годятся только для охоты в сухую тёплую погоду? Нет, это не так. Но к выбору «Спортинга» для охоты стоит подходить несколько иначе, чем для стенда. Для стенда (для тренировок, по крайней мере) покупаешь часто тот патрон, что дешевле. А вот для охоты надо брать скоростные патроны — со скоростью V0,5 хотя бы 400 м/с. Я, например, много лет уже в любую погоду, вплоть до температуры -5 и даже ниже, охочусь патронами типа «Спортинг» NRG Flash («Азот»), Была ещё такая «клубная» серия патронов GUNS. RU (тоже «Азот») — тоже «Спортинг» 28 г с V0,5 чуть не 415 м/с. Для тренировок этот патрон мог показаться даже «жестковатым», на любителя, но как охотничий был просто выше всяческих похвал.

В общем, у патронов «Спортинг» с дробью 7,5 с высокой начальной скоростью (V0,5 от 400 и выше) есть запас по температуре окружающей среды, при котором они одинаково надёжно работают на охотничьих расстояниях.

И в завершение ещё один плюс мелкой дроби — для эстетов и тех, кто стреляет действительно много дичи, а не от случая к случаю. «Семёрка» не разбивает кишечник уток (а также тетеревов и даже куропаток на средних дистанциях) даже при чисто угонном выстреле. «Пятёркой» стреляешь на 25 метров, и если попал центром, вероятность того, что содержимое кишечника будет в брюшной полости (а следовательно, в гастрономическом плане трофей уже будет пригоден лишь условно), уже 50/50. А «семёркой» даже на 15 метров иногда думаешь: «Разбил же в хлам!» — а птица в итоге чистая, хотя сквозных попаданий на тушке десятка два!    

мелкая дробь в предложении

Эти примеры взяты из корпусов и из источников в Интернете. Любые мнения в примерах не отражают мнение редакторов Cambridge Dictionary, Cambridge University Press или его лицензиаров.

Только малых фракция электронов могла покинуть образец.

Только малых фракций рас являются действительно конкурентоспособными в том смысле, в каком это предполагают пространственные модели.

Они составляли всего малых фракции всех занятых там людей.

На начальном этапе инновация медленно распространяется среди очень небольшой фракции населения.

Экспрессия small фракции клеточных генов изменяется в ответ на гиперацетилирование гистонов.

При = 0,39 м мелких фракций попутных частиц вносят вклад в демпфирование.

Однако маленьких фракций гемангиом «полностью сформированы» при рождении.

Только малых фракций всех случаев вовлечены в признанные вспышки пищевого происхождения.

Эти сообщенные цифры представляют собой малую фракцию всех болезней пищевого происхождения.

Однако обратите внимание, что это small дробь от общего количества белых вопросов.

Только малых фракций сперматозоидов конденсируются через шахматные интервалы.

Во-первых, только малых фракция домашних дров состоит из вырубленных деревьев.

Но если принять во внимание партийность, класс и идеологию, она сокращается до малой дроби .

Эти результаты очень похожи (обычно только small дробь на один процентный пункт лучше).

Всего маленьких Фракция (4,7%) пациентов дали ответы, которые можно интерпретировать как протесты.

Этот квартирный платеж составляет относительно небольшую часть общего дохода семьи.

В отличие от многих других видов рака, только малых случаев рака простаты являются агрессивными и опасными для жизни.

Как и в случае с национальными схемами, местные агентства смогли предоставить только малых части потенциально подходящих заявителей.

Пропорциональность регулируется так, что только малых фракций (y10%) молекул перемещаются на каждом временном шаге.

Если барионное число сохраняется, то можно извлечь только малую фракцию энергетического содержания вещества.

Предприниматели4 составляют небольшую фракцию населения (около 10%), но владеют большой долей в общем богатстве (около 40%).

Разница между экспериментальным и желаемым конечным пунктом назначения составила всего малых долей от общей длины пути.

Однако кажется возможным, что малых фракций генов самонаводящихся эндонуклеаз в процессе эволюции приобрели более полезную для хозяина роль.

Эти примеры взяты из корпусов и из источников в Интернете. Любые мнения в примерах не отражают мнение редакторов Cambridge Dictionary, Cambridge University Press или его лицензиаров.

определение мелкой дроби | Словарь английских определений

малый


прил

1 сравнительно мало; ограничены по размеру, количеству, важности и т. д.

2 малозначительные или второстепенные
малые предприятия

3 отсутствие моральной или умственной широты или глубины
слабый ум

4 скромных или скромных
маленьких начинаний

5 низкого или более низкого статуса, особенносоциально

6 (ребенка или животного) молодняк; незрелые

7 неважно, банально
мелочь

8 не выдающийся
маленький актер

9 из, относящиеся или обозначающие обычную современную миниатюрную букву, используемую в печатном и скорописном письме
Сравнить → столица 1 → 13

См. Также
→ нижний регистр

10 недостаточная сила или сила
малое усилие

11 с мелкими частицами
мелкий гравий

12 устаревшие (пива и т. Д.) слабой крепости
ADV

13 на мелкие кусочки
нарезать мелко

14 мелко или мягко

15 ♦ чувствовать себя маленьким быть униженным или униженным
n

16 часто предшествуют: объект, человек или группа, которые считаются маленькими
маленькими или большими?

17 небольшая тонкая деталь, особенно.спинки

18 pl
Неофициальные (в основном британские) предметы личной стирки, такие как нижнее белье
(древнеанглийское smæl; связано с древневерхненемецким малым, древнескандинавским мелким рогатым скотом)
малый прил
малая n

маленькое объявление , маленькое объявление
n короткое, просто оформленное объявление в газете или журнале, обычно полностью размещенное в небольшом размере типа
См. → Показать рекламу

стрелковое оружие
pl n переносное огнестрельное оружие относительно малого калибра

мелкое пиво
n
Неформальные (в основном британцы) люди или неважные вещи

малокалиберный
adj (огнестрельного оружия), имеющий малый диаметр ствола, особенно менее.22 калибр

малокалорийный
n другое название для → калорийность

маленькая заглавная
n буква, имеющая форму заглавной буквы, но той же высоты, что и строчная буква

мелкая сдача
n

1 монеты, особенно малоценные

2 человек или вещь, которая не является выдающейся или важной

small chop
pl n (W African) коктейльные закуски

малый круг
n круговое сечение сферы, не содержащее центра сферы
Сравнить → большой круг

Суд мелких тяжб
n (Brit. и канадский) местный суд, обладающий юрисдикцией рассматривать гражданские иски по мелким искам

мелочь
pl n

1 человек или вещи, считающиеся неважными

3 молоди или рыбки

мелкая дичь
n (брит.) Мелкие животные, на которых охотятся в спортивных целях

мелкие товары
pl n (Austral.и Н.З.) мясо, купленное в кулинарии, например колбасы

малые часы
pl n р. рано утром, после полуночи и до рассвета

тонкий кишечник
n самая длинная часть пищеварительного тракта, состоящая из двенадцатиперстной, тощей и подвздошной кишок, в которой пищеварение завершено
Сравнить → толстый кишечник

строчная буква
n строчная буква

недалекий
прил недалекий; мелкий; нетерпимый; среднее
недалекий adv
ограниченность n

small pica
n (ранее) размер шрифта принтера примерно равен 11 пунктам

мелкий картофель
n функционирует как sing or pl
Неформальный (в основном U. S. и Canadian) кто-то или что-то мало значимое или ценное, особенно небольшая сумма денег

мелкий шрифт
n материал в контракте и т. Д., Напечатанный мелким шрифтом, особенно. считается ловушкой для неосторожных

мелкое
прил

1 ограниченного размера или объема

2 (карты, модели и т. Д.), Дающее относительно небольшое представление о чем-либо, обычно с упущением деталей

маленький экран
n неофициальное название для → телевизор

small slam
n (Bridge) другое название для → маленький шлем

небольшие магазины
pl n (Navy) личные вещи, такие как одежда, проданные на борту корабля или на военно-морской базе
Сравнить → отстойник

мелкий материал
n (морской) любой легкий шпагат или пряжа, используемые на борту судна для линий обслуживания и т. Д.

светская беседа
n легкая беседа для общественных мероприятий

мелкий
прил
Неформальный незначительный; несовершеннолетний
мелкий преступник
малая n

маленькая белая
n маленькая белая бабочка Artogeia rapae со скудными черными отметинами, личинки которой питаются листьями brassica

Синонимы дроби | Тезаурус Мерриам-Вебстера

Тезаурус

сломанная или неправильная часть чего-то, что часто остается неполным
  • , если даже крошечная дробь этого печенья отломится и упадет в хрупкие часы, это может все испортить

Слова, относящиеся к дроби

  • атом,
  • крошка,
  • ведение,
  • флек,
  • муха,
  • зерно,
  • гранула,
  • молекула,
  • кусочек,
  • пылинка,
  • нуббин,
  • самородок,
  • частица,
  • патч,
  • совесть,
  • ножница,
  • фрагмент,
  • пятнышко,
  • Титтл
См. Определение словаря

границ | Небольшая часть предшественников дифференцируется в зрелые адипоциты, избегая ограничений на клеточную структуру

1.

Введение

Клеточные культуры содержат популяции неидентичных клеток. Ранее было признано, что культуры клеток преадипоцитов гетерогены. Грин и др. . описали гетерогенную природу дифференцирующихся клеток 3T3-L1 (Green and Kehinde, 1975). Ли и др. (2019) показали, что предшественники адипоцитов в одном жировом депо дают начало функционально различным адипоцитам. Клеточные культуры никогда не достигают 100% эффективности дифференцировки; таким образом, только часть преадипоцитов отвечает.Ключевой вопрос — насколько велика или мала эта фракция. Loo и др. . показали, что меньшая часть преадипоцитов дает начало зрелым адипоцитам с характерной экспрессией генов и липидными каплями (Loo et al., 2009).

Различная реакция клетки на индукционные среды может быть связана с их внутренними свойствами или является случайным процессом. Было высказано предположение, что стохастичность и межклеточные взаимодействия являются ключевыми факторами дифференцировки стволовых клеток (Smith et al. , 2015).Если преадипоциты по своей сути различны, мы, в принципе, должны быть в состоянии найти механизмы, которые придают чувствительность / устойчивость субпопуляциям. Исследование показало, что способность адипоцитов созревать и накапливать жир передается по наследству. Модификация ключевого адипогенного фактора транскрипции пероксисомного пролифератора-активируемого рецептора гамма ( Pparg ) промоторной области отмечает способность клеток дифференцироваться и повторно дифференцироваться (Katz et al., 2014).

Дифференциация — это событие транскрипционного и морфологического развития.Клетки пролиферируют только в течение 1 дня после индукции 3T3-L1 в так называемом постконфлюэнтном митозе с последующей остановкой роста (Bernlohr et al., 1985). Деление клеток и репликация ДНК необходимы, чтобы факторы транскрипции проникли в открытый хроматин. Это, в свою очередь, стимулирует развитие нового фенотипа. В течение нескольких дней клетка накапливает липиды в каплях и трансформирует свою внутреннюю часть в отдельную жировую клетку.

Изменения цитоскелета и внеклеточного матрикса редко обнаруживаются при исследовании дифференцировки адипоцитов.Это прискорбно, учитывая их первостепенное значение для морфологического развития адипоцитов. Это ясно из исследований, проведенных на стволовых клетках с потенциалом дифференцировки; они должны отвечать на внеклеточные сигналы, не только модулируя экспрессию генов, но и их внутреннюю структуру (Yourek et al., 2007; Guilak et al., 2009). Ян и др. (2013) показали, что ремоделирование цитоскелета посредством ацетилирования альфа-тубулина необходимо для дифференцировки преадипоцитов. Более того, было даже высказано предположение, что актиновый цитоскелет может вмешиваться в транскрипционную регуляцию процесса дифференцировки, контролируя транслокацию антагонистических ядерных факторов (Nobusue et al., 2014).

Профилирование с помощью RNA-Seq — эффективный способ изучения изменений экспрессии генов между двумя или более состояниями. Однако сигнал экспрессии в этом случае усредняется по смешанной популяции клеток различных типов. Одноклеточная РНК-Seq (scRNA-Seq) — самый простой способ проверить экспрессию гена на уровне отдельных клеток. Поскольку эти наборы данных не всегда доступны, альтернативой может быть деконволюция массивных данных RNA-Seq. В этом исследовании субпопуляции в смеси оценивались по их генным сигнатурам и изучались отдельно.

Выпуклый анализ смесей (CAM) — это неконтролируемый метод деконволюции профилей образцов смешанных фенотипов на их составляющие (Wang et al., 2016). Создатели метода применили его к набору данных об экспрессии генов у дрожжей на разных стадиях клеточного цикла. CAM может обнаруживать совокупность субпопуляций в соответствии с истинными ярлыками. Кроме того, маркеры генов субпопуляций, идентифицированные с помощью САМ, были связаны с соответствующими фазами. Herrington et al. (2018) использовали этот метод для получения различных фенотипов в тканях артерий.Классификация типов клеток на основе их маркеров соответствовала активации пути альфа-фактора некротического фактора опухоли (TNF).

Здесь мы описываем деконволюцию экспрессии гена дифференцирующихся преадипоцитов 3T3-L1 из данных объемной РНК-Seq. Цель состоит в том, чтобы определить отдельные фенотипы в культурах клеток и оценить их доли. Затем мы показали, какие из этих фракций ответили на индукционные стимулы и стали зрелыми адипоцитами. Наконец, мы попытались объяснить различия между субпопуляциями в том, в каких функциях участвуют их специфические маркеры, какой тип клеток они вызывают в конце курса дифференцировки, и их ответ на лечение различными лекарствами и соединениями.

2. Материалы и методы

2.1. Культура клеток и дифференциация

3T3-L1 представляет собой линию клеток преадипоцитов мыши, которая может быть индуцирована к дифференцировке в зрелые адипоциты при обработке химическим коктейлем. Известно, что химический коктейль из 1-метил-3-изобутилксантина, дексаметазона и инсулина (MDI) вызывает дифференцировку (Green and Kehinde, 1975). Лечение начинается с полностью слившейся культуры клеток 3T3-L1 (преадипоцитов), в которой липид накапливается в липидные капли в течение нескольких дней. Временной ход состоит из трех этапов; 2–4 день, ранний; до 7 дня промежуточный; до 14 дней — стадия поздней дифференцировки. Подобный протокол дает сопоставимый курс дифференцировки в первичных преадипоцитах человека.

2.2. Обработка и обработка данных

2.2.1. Данные RNA-Seq

Мы исследовали репозитории GEO и SRA на предмет данных высокопроизводительного секвенирования MDI-индуцированных образцов 3T3-L1 и первичных преадипоцитов человека в разные моменты времени (таблица 1). В исследование было включено 98 образцов RNA-Seq.Этот набор данных был ранее курирован, а обработанные данные были упакованы в пакет экспериментальных данных Bioconductor, курируемый AdipoRNA (Ahmed and Kim, 2019). Вкратце, необработанные чтения были загружены с ftp-сервера SRA с помощью Wget. FASTQC использовался для оценки качества необработанных чтений (Andrews, 2020). Для RNA-Seq необработанные считывания были сопоставлены с геномом мыши UCSC mm10 с использованием HISAT2 (Kim et al., 2015). FeatureCounts использовался для подсчета выровненных чтений (bam) в известных генах (Liao et al., 2014).

Таблица 1 .Наборы данных RNA-Seq дифференцирующихся клеток 3T3-L1.

2.2.2. Данные микрочипа

Мы провели аналогичный обзор литературы для исследований, в которых одна и та же модель клеточной линии подвергалась химическим или генетическим нарушениям (таблица 2). Сорок два микрочипа зрелых адипоцитов (> 7 дней после индукции MDI), обработанных тиазолидиндионами (TZD), четырьмя короткоцепочечными жирными кислотами (SFA) или тремя нестероидными противовоспалительными препаратами (NSAID), были предварительно собраны и проанализированы. Обработанные данные были упакованы в другой пакет экспериментальных данных, курируемый AdipoArray (Ahmed et al., 2020). Кроме того, 24 образца микрочипов первичных преадипоцитов человека, индуцированных MDI, были загружены из GEO в виде обработанных интенсивностей зондов (GSE98680) (Verbanck et al., 2017).

Таблица 2 . Наборы данных микрочипов дифференциации 3T3-L1 при фармакологических нарушениях.

Данные микроматрицы

были загружены из GEO в виде значений интенсивности зонда. Метаданные зонда (символы генов) использовались для свертывания интенсивностей на генный уровень с использованием максимального среднего (Horvath and Dong, 2008).Данные были нормализованы с использованием нормализации между массивами, а пакетные эффекты были удалены с использованием эмпирических байесовских корректировок (Ritchie et al., 2015; Leek et al., 2020).

2.3. Идентификация популяций адипоцитов

Конвексный анализ смесей (CAM) был использован для деконволюции профилей экспрессии подсчета генов (Wang et al., 2016). Этот анализ был применен с использованием debCAM (Chen, 2020). Вкратце, симплекс рассеяния смеси клеток представляет собой повернутую и сжатую версию симплекса рассеяния чистых субпопуляций (рис. 1).Субпопуляции и их маркеры находятся на концах фигуры. Кратное изменение «один против всех» было рассчитано для всех генов и использовано для выбора генных маркеров. Используя экспрессию маркеров, относительные доли субпопуляций в смеси оценивали стандартизированным усреднением. Расчетные доли использовались для деконволюции смешанных выражений в профили конкретных подгрупп населения с помощью регрессии наименьших квадратов.

Рисунок 1 . Схема дизайна исследования.Выпуклый анализ смесей (CAM) применяли к MDI-индуцированной временной экспрессии гена 3T3-L1 для оценки субпопуляции (1) маркеров (2) фракций и (3) профилей специфической экспрессии. Маркеры были протестированы на избыточное представительство в наборах генов (ORA). Фракции субпопуляций были проверены в первичных адипоцитах, а профили экспрессии были исследованы на предмет известных сигнатур генов.

2.4. Проверка маркеров и популяций

Мы подтвердили анализ, используя перестановки идентифицированных маркеров и независимый набор данных профилей экспрессии генов из первичных адипоцитов. Чтобы изолировать влияние размера набора маркеров генов и выбросов, фракции субпопуляций были повторно оценены с использованием меньшего набора, выбранного случайным образом из идентифицированных маркеров. Размер набора был выбран равным размеру самой маленькой подгруппы населения. Тот же процесс повторялся несколько раз для каждой перестановки маркеров. Применяли контролируемую версию САМ с использованием профилей экспрессии первичных адипоцитов человека с использованием полного набора маркеров.

2,5. Чрезмерное представительство генной группы

Списки специфических маркеров субпопуляций были аннотированы с использованием терминов генной онтологии (org.Mm.eg.db) и протестирован на избыточное представление с помощью ClusterProfiler (Yu et al., 2012; Carlson, 2020). Для каждого набора генов наблюдаемая доля гена в списке сравнивалась с долей, ожидаемой случайно. Значения P были рассчитаны для каждого набора генов и скорректированы для множественного тестирования с использованием коэффициента ложного обнаружения (FDR).

2.6. Анализ дифференциальной экспрессии

Влияние лечения лекарствами и соединениями на экспрессию генов зрелых адипоцитов оценивали на уровне смеси и популяции.Дифференциальную экспрессию генов между экспериментальной и контрольной группами рассчитывали с использованием LIMMA (Ritchie et al., 2015). Популяционно-специфический анализ экспрессии генов был применен к тем же сравнениям с использованием PSEA (Kuhn et al., 2011). Ранее идентифицированные маркеры трех субпопуляций были использованы для построения эталонной популяции и проведения однозначных сравнений. Значения P были рассчитаны для каждого гена и скорректированы для множественного тестирования с использованием FDR.

2.7. Программное обеспечение и воспроизводимость

Анализ был проведен в R и с использованием пакетов Bioconductor (Huber et al., 2015; R Core Team, 2020). Программная среда доступна в виде образа докера (https://hub.docker.com/r/bcmslab/adipo_deconv). Код для воспроизведения рисунков и таблиц в этом документе находится в открытом доступе (https://github. com/BCMSLab/adipo_deconv).

3. Результаты

3.1. Культуры клеток преадипоцитов состоят из трех отдельных субпопуляций

Усреднение экспрессии гена в данном образце отражает доминантные фенотипы клеток в ходе дифференцировки.Преадипоциты были непохожи на клетки с ранней и поздней дифференцировкой. В качестве меры различия мы использовали расстояния между образцами внутри и между ступенями. Расстояния внутри образцов преадипоцитов отличались от ранних ( t = 24,07; P <0,01) и позднодифференцированных ( t = 30,05; P <0,01) образцов. Более того, стадия дифференциации объясняет примерно половину дисперсии между выборками (рис. 2А). Недифференцированные и дифференцирующиеся клетки, разделенные по первым двум измерениям ( k = 2; степень соответствия> 0.47) попарных расстояний соответствующих выборок.

Рисунок 2 . Уменьшение размеров и деконволюция экспрессии генов дифференцирующихся адипоцитов. Экспрессию генов MDI-индуцированных преадипоцитов 3T3-L1 ( n = 98) и первичных адипоцитов человека (HPP) ( n = 24) определяли с помощью RNA-Seq или микрочипов в разное время. (A) Евклидовы расстояния между образцами были рассчитаны по количеству трансформированных генов. Образцы были размещены в двух измерениях, чтобы приблизить расстояния, и раскрашены по стадиям (S0, S1 или S2) для неиндуцированной, ранней или поздней дифференциации. (B) Симплекс рассеяния смеси ячеек представляет собой повернутую и сжатую версию симплекса рассеяния чистых субпопуляций. В двух измерениях субпопуляции (P1, P2 и P3) и их маркеры располагаются на конечностях. (C) Используя эти маркеры, относительные доли субпопуляций в смеси дифференцирующих 3T3-L1 оценивали стандартизированным усреднением. (D) Относительные доли субпопуляций в смеси дифференцирующих HPP оценивали стандартизированным усреднением тех же маркеров.

Культуры клеток 3T3-L1 до и после индукции дифференцировки состоят из смесей клеток. Средней экспрессии достаточно для изучения изменений экспрессии генов с течением времени, но сигнал каждого гена потенциально является составной частью его экспрессии в двух или более типах клеток. Они могут различаться по своим фенотипам и / или генотипам. На каждой стадии / момент времени дифференциации состав культуры может отличаться, и фракции субпопуляций могут меняться. Деконволюция экспрессии генов дифференцирующихся адипоцитов поможет решить эти вопросы.

Для определения субпопуляций в культурах мы применили выпуклый анализ смесей (CAM) к смешанным профилям экспрессии генов дифференцирующихся адипоцитов. Симплекс разброса выражения смеси представляет собой преобразованную версию выражения чистых субпопуляций. При проецировании в малых размерах мы наблюдали три различных архетипа, характерных по крайней мере для трех групп клеток (рис. 2В). Генные маркеры этих субпопуляций были идентифицированы как гены, которые по-разному экспрессируются в одной субпопуляции по сравнению сдругие (кратность изменения> 1; начальный доверительный интервал нижней границы> 0) (рисунок 3A и дополнительный файл 1). Маркеры использовались для оценки относительных фракций и профилей экспрессии субпопуляций.

Рисунок 3 . Маркеры генов субпопуляций и фракции дифференцирующихся адипоцитов. Экспрессию генов MDI-индуцированных преадипоцитов 3T3-L1 ( n = 98) определяли с помощью RNA-Seq в различные моменты времени. Выпуклый анализ смеси использовали для оценки относительных долей субпопуляций культур и их конкретных профилей экспрессии. (A) Кратное изменение «один против всех» (log 1 0) было рассчитано для всех генов. Показано кратное изменение 5 главных генов в каждой субпопуляции (P1, P2 и P3). (B) Наборы маркеров подгруппы населения (размер набора = 35; номер итерации = 100) были повторно взяты из первоначально идентифицированных маркеров генов. Наборы маркеров использовались для повторной оценки относительных долей субпопуляций (P1, P2 и P3) в смеси путем стандартизованного усреднения. Средние фракции показаны сглаженными линиями (синие), а стандартные ошибки показаны лентами (серыми).

Различные наборы маркеров подгруппы населения дали образцы, не сильно отличающиеся от приведенных выше. Мы выбрали случайные наборы маркеров одинакового размера для трех подгрупп (бутстрэппинг). Уменьшение количества маркеров и случайная повторная выборка из исходного набора дали аналогичные оценки долей трех популяций в большинстве моментов времени (коэффициент вариации <10%; смещение <0,1) (рисунок 3B).

3.2. Зрелые адипоциты происходят из небольшой фракции преадипоцитов

Исходная культура клеток состоит из непропорциональных фракций фенотипов, которые меняются со временем (рис. 2С).Одна из трех групп (P1) составляет более 95%, а остальные представляют собой смесь двух других групп. В процессе дифференцировки доля клеток доминирующей группы снижается до менее 40% от поздних выборок. В ответ на индукционный стимул две фракции клеток первоначально увеличивают свою долю в культуре. Только одна группа (P2) продолжает увеличиваться в размерах до конца и достигает более 60% ячеек.

Три субпопуляции были идентифицированы на основе их профилей экспрессии специфических генов.Адипогенные и липогенные гены пометили вторую субпопуляцию (P2) как те, которые отвечают на индукционный стимул и формируют зрелые клетки (рис. 4А). В первую группу генов вошли факторы транскрипции Pparg и Cebpb , участвующие в регуляции процесса дифференцировки. Они были высоко выражены в P2 по сравнению с двумя другими субпопуляциями (кратность изменения> 7; более низкий доверительный интервал> 0). Вторая группа генов кодирует ключевые ферменты, такие как Fasn и Lpl в пути синтеза липидов, и они необходимы для накопления липидов.Они также были выражены на более высоком уровне в P2 (кратность изменения> 1,5; более низкий доверительный интервал> 0).

Рисунок 4 . Субпопуляционная специфическая экспрессия генов в дифференцирующихся адипоцитах. Экспрессию генов MDI-индуцированных преадипоцитов 3T3-L1 ( n = 98) определяли с помощью RNA-Seq в различные моменты времени. Выпуклый анализ смеси использовали для оценки относительных долей субпопуляций в культурах. Расчетные доли использовались для деконволюции смешанных выражений в профили конкретных подгрупп населения с помощью регрессии наименьших квадратов. (A) Экспрессия маркеров адипогенных и липогенных генов показана в трех субпопуляциях. (B) Экспрессия сигнальных генов инсулина показана в трех субпопуляциях. (C) Коэффициент ранговой корреляции Спирмена ( r s ) среди экспрессии генов в субпопуляциях дифференцирующих 3T3-L1 и первичных адипоцитов человека (HPP) был рассчитан и показан в виде значений цвета (белый, низкий; синий, высокий). Подгруппы обозначены как (P1, P2 и P3), а выражение — как значения цвета (белый, низкий; синий, высокий).

Различия в экспрессии генов между двумя субпопуляциями распространялись не только на адипогенные и липогенные гены. Гены, связанные с метаболизмом инсулина, по-разному экспрессировались в дифференцирующейся подгруппе (P2) по сравнению с двумя другими (кратность изменения> 3; более низкий доверительный интервал> 1,7) (Рисунок 4B). Хотя рецептор инсулина ( Insr ) и его субстрат ( Irs1 ) экспрессировались в двух основных субпопуляциях, член 4 семейства растворенных переносчиков глюкозы, член 4 (Slc2a4) , экспрессировался только в P1.Эксклюзивная экспрессия субъединицы B фактора роста тромбоцитов ( Pdgfb ) в P2 указывает на нечувствительность клеток к глюкозе.

Подобная смесь субпопуляций составляла культуру клеток первичных преадипоцитов человека. Фракции первичных клеток, соответствующие ранее идентифицированным маркерам, напоминали фракции, оцененные из культур 3T3-L1 (рисунок 2D). Одна субпопуляция (P2) выросла, чтобы доминировать в конечной культуре дифференцированных клеток MDI. Остальные (P1 и P3) не ответили или ответили кратко.Профили экспрессии генов субпопуляций в первичных клетках были аналогичны таковым в модели клеток мышей (рис. 4C). Поскольку профили экспрессии происходят из двух разных типов клеточных линий, экспрессия субпопуляций в каждой сильно коррелировала (коэффициент ранговой корреляции Спирмена ( r s )> 0,6; P <0,001). В то же время соответствующие субпопуляции сильно коррелировали между двумя клеточными линиями.Так было для P1 ( r s = 0,47; P <0,001) и P2 ( r s = 0,4; P <0,001). Единственным исключением была более слабая корреляция P3 ( r s = 0,2), которая была меньше, чем у P3 мыши с P1 человека ( r s = 0,4; P <0,001. ).

3.3. Субпопуляции зрелых адипоцитов по-разному реагируют на различные соединения

Если на самом деле зрелые адипоциты представляют собой смесь разных субпопуляций, мы ожидаем увидеть гетерогенный ответ на лечение разными соединениями.Мы собрали данные из адипоцитов, индуцированных MDI, после 7-го дня и обработали их различными соединениями. Эти соединения включали три тиазолидиндиона (TZD), четыре короткоцепочечных жирных кислоты (SFA) и три нестероидных противовоспалительных препарата (NSAID). Ответ клеточной смеси оценивали с помощью регулярного дифференциального выражения, а ответ субпопуляций оценивали с помощью анализа популяционно-специфической экспрессии (PSEA). Сравнивая реакцию смеси адипоцитов с ответом отдельных субпопуляций, мы могли идентифицировать действие каждого соединения конкретно на зрелые адипоциты.

Мы обнаружили, что соединения из одного и того же семейства вызывали аналогичные ответы, как и ожидалось (рис. 5A). Реакция на TZD: розиглитазон, пиоглитазон, троглитазон в отношении средней экспрессии генов сильно коррелировала (коэффициент корреляции Пирсона ( r )> 0,5; P <0,001). Аналогично, кратность изменения ответа на лечение SFA и NSAID коррелировала ( r > 0,4 ​​и r > 0,6; P <0,001). Были обнаружены лишь небольшие корреляции между ответом на кратность изменения между группами соединений.Лечение TZD положительно коррелировало с НПВП и отрицательно коррелировало с лечением SFA. НСПВП и НЖК отрицательно коррелировали.

Рисунок 5 . Смесь и субпопуляционная специфическая реакция зрелых адипоцитов на фармакологические нарушения. MDI-индуцированные зрелые адипоциты 3T3-L1 (> 7 дней) обрабатывали диметилсульфоксидом (DSMO), нестероидными противовоспалительными препаратами (NSAID), короткоцепочечными жирными кислотами (SFA) или тиазолидиндионами (TZD). Экспрессию генов в образцах ( n = 42) определяли с помощью микрочипов.Ранее идентифицированные маркеры генов специфических субпопуляций (P1, P2 и P3) в клетках 3T3-L1 использовали для оценки профилей экспрессии, специфичных для субпопуляций. (A) Корреляции между кратным изменением реакции на лечение показаны в виде цветовых значений (синий — отрицательный; красный — положительный). (B) Распределение кратности изменения 500 лучших дифференциально экспрессируемых генов в смеси и субпопуляциях в ответ на розиглитазон, ибупрофен и стеариновую кислоту.

Ответ на уровне субпопуляции на лечение различными соединениями часто отличался от смеси и друг от друга (рис. 5B и дополнительный файл 2). Лечение розиглитазоном вызывало более выраженную дифференциальную экспрессию в P2 по сравнению с другими популяциями (тест KS D <0,15; P <0,001), а также смесью ( D <0,24; P <0,001). Аналогичная картина наблюдалась при лечении ибупрофеном ( D <0. 13; P <0,001). Напротив, P1 отличался больше, когда адипоциты обрабатывали стеариновой кислотой ( D = 0,43; P <0,001).

3.4. Динамическая модель двух субпопуляций в полностью слившейся клеточной культуре

Чтобы показать достоверность этих наблюдений, мы построили модель динамики субпопуляций и сравнили ее с дальнейшими наблюдениями на основе данных. В этой модели две субпопуляции разного размера растут с разной скоростью в ответ на окружающую среду в полностью конфлюэнтной культуре клеток (рис. 6А). P 2 — это небольшая подгруппа, которая растет со скоростью r , rP 1, а P 1 — большая подгруппа, размер которой уменьшается с меньшей или такой же скоростью — r , — rP 1. В этом случае общий размер популяции ( N ) можно оценить как ( P 2 — P 1) r . Это предсказывает, что общая популяция ( N ) должна сначала уменьшиться и отскочить до того же размера или выше через 2 дня, при небольшом значении r . Эту систему можно резюмировать следующим образом:

Полностью конфлюэнтная культура клеток накладывает ограничение на скорость, с которой субпопуляции могут расти или погибать ( r ). Мы выбрали значение, которое восстанавливает размер популяции в течение разумного периода времени (2 дня). Скорость, с которой может расти одна популяция, ограничена скоростью, с которой уменьшается размер другой популяции. Значения начальных состояний ( P 1, P 2 и N ) были предложены в предыдущем анализе, где растущая субпопуляция представляет собой небольшую долю от общего количества в начале культивирования клеток.

Рисунок 6 . Субпопуляционная динамика и сигнатура экспрессии генов клеточного цикла в дифференцирующихся адипоцитах. (A) Игрушечная модель двух субпопуляций P 1 и P 2, растущих со скоростью — r и r , соответственно, и всего населения N . Изменение общего количества клеток и каждой субпопуляции рассчитывали с течением времени при разумных начальных состояниях и значениях параметров. (B) Экспрессию генов MDI-индуцированных преадипоцитов 3T3-L1 ( n = 42) определяли с помощью RNA-Seq в трех временных точках.Кумулятивная функция распределения генов восьмиклеточного цикла в дифференцирующихся адипоцитах через 0, 24 и 48 часов. (C) Распределение экспрессии генов восьмиклеточного цикла в дифференцирующихся адипоцитах в одни и те же моменты времени. (D) Ранее идентифицированные генные маркеры, специфичные для субпопуляций (P1 и P2), использовали для оценки профилей экспрессии, специфичных для субпопуляций. Для оценки дифференциального выражения между 24 и 0 часами и между 48 и 24 часами использовались регрессионные модели.Показаны частичные остатки каждого сравнения и популяционно-специфическое выражение.

3.5. Индекс клеточного цикла соответствует динамике двух субпопуляций

Мы использовали сигнатуру экспрессии гена ( Mki67, Rb1, Hist1h3ae, Ccnb1, Cbx3, Gapdh, Ccnb2 и E2f1) для оценки фазы клеточного цикла на уровне популяции и субпопуляции (Dolatabadi et al. , 2017). Мы обнаружили, что адипоциты на 1-й день имели более высокую нестабильность клеточного цикла, чем преадипоциты (тест KS D = 0.7; P <0,01) и адипоцитов на 2 день ( D = 0,5; P > 0,05) (Рисунок 6B). Этот паттерн отражает более высокую экспрессию генов клеточного цикла на 1 день по сравнению с преадипоцитами (оценка обогащения = 0,7; P <0,05) и адипоцитами на 2 день (оценка обогащения = 0,6; P > 0,05), что указывает на большая доля клеток в фазе G0 / S и, следовательно, менее активные деления (рис. 6C). Это соответствовало прогнозируемой численности популяции игрушечной модели.

Дифференциальная экспрессия, специфичная для субпопуляций, подтвердила, что две популяции по-разному вносят вклад в экспрессию генов клеточного цикла и, следовательно, в активное деление клеток (рис. 6D). Это видно из корреляции между экспрессией генов клеточного цикла и эталоном (популяционными сигналами). Из этого анализа неясно, как присвоить конкретные значения каждой подгруппе при каждом из двух сравнений. Это связано с тем, что экспрессия рассчитывается для каждого из восьми генов индивидуально.Более того, индекс отражает не дискретные категории, а непрерывный переход от фазы G1 к фазе S клеточного цикла. На это будет влиять размер популяции в разные моменты времени и, следовательно, их вклад в общую экспрессию генов, составляющих индекс.

3,6. Устойчивость к дифференцировке может быть обусловлена ​​структурными ограничениями клетки и / или приверженностью другим линиям

Несколько функциональных наборов генов были перепредставлены (количество ≥ 3; частота ложных открытий <0.2) в группе маркеров растущей подгруппы (П2). Они были связаны с дифференцировкой жира, ядерными рецепторами и транскрипционной активностью (Таблица 3). Более конкретно, многие из характерных маркеров были частью процесса дифференцировки бурых жировых клеток . Молекулярные функции, такие как ядерный рецептор и активность стероидного гормона , были чрезмерно представлены в той же группе. Некоторые из этих маркеров локализованы в клеточных компонентах, таких как комплекс фактора транскрипции .С другой стороны, фенотип, который не проявлял этих характеристик, можно было рассматривать как сопротивление индукционному стимулу. Действительно, совершенно разные процессы и функции были перепредставлены маркерами двух других популяций.

Таблица 3 . Избыточное представительство генного набора в маркерах специфических генов субпопуляций.

Маркеры других субпопуляций были обогащены терминами, связанными с клеточными структурными процессами и компонентами (Таблица 3).Первая группа (P1) имела множественные маркеры, относящиеся к митотическому веретену , микротрубочкам, актину и цитоскелету . Все они являются важными компонентами клеточной структуры и необходимы для морфологических изменений. Помимо этих терминов, некоторые процессы, связанные со сборкой и организацией этих компонентов, были обогащены маркерами P1.

Третья группа (P3) включала термины, относящиеся к структурным компонентам, а именно: внеклеточный матрикс и молекулярные функции структурный компонент цитоскелета , обогащенный его маркерами. Но также термины биологических процессов, связанные с дифференцировкой типов клеток, отличных от адипоцитов, нейронов и дифференцировки кератиноцитов были чрезмерно представлены в наборе маркеров P3.

4. Обсуждение

Мы обнаружили, что культура клеток преадипоцитов состоит из трех различных субпопуляций. После индукции дифференцировки меньшая часть клеток растет и превращается в зрелые адипоциты. Эта фракция клеток имеет профиль экспрессии генов, способствующий деятельности, связанной с ядерными рецепторами, дифференцировкой жира и транскрипцией генов.Субпопуляции клеток, которые не реагируют на индукцию, находятся под структурными ограничениями или готовы дифференцироваться в другие типы клеток. Рисунок 7 суммирует эти наблюдения в графическом представлении, которое мы обсудим ниже.

Рисунок 7 . Модель дифференцирующихся субпопуляций адипоцитов. Часть преадипоцитов, растущих в среде дифференцировки, реагирует на адипогенные стимулы. Реагирующие клетки (P2) претерпевают морфологические изменения и накапливают липиды в мелкие капельки.Адипоциты достигают зрелости после удаления внутриклеточных органелл и консолидации жира в более крупные капли. Клетки, которые не могут преодолеть структурные ограничения (P1 и P3), например, в цитоскелете и внеклеточном матриксе, не претерпевают морфологических изменений и остаются недифференцированными.

Выявление факторов, которые делают фибробласты чувствительными или устойчивыми к индукционной среде, может помочь в достижении большей эффективности дифференцировки. Что еще более важно, это улучшило бы наше понимание состава жировой ткани и того, как стимулировать или препятствовать конечному созреванию адипоцитов.

В контексте CAM исключительно обогащенные гены в подмножестве клеток являются маркерами для набора (Wang et al., 2016). Экспрессия других генов (коэкспрессия) представляет собой комбинацию их экспрессии в субпопуляциях. Экспрессия всех генов в смеси образует k-мерный симплекс с выразительной геометрией. Симплексная форма включает данные, а субпопуляции с их маркерами находятся в крайних точках.

Чтобы продемонстрировать достоверность этих результатов, необходимо показать, что (1) культуры преадипоцитов состоят из отдельных популяций и что (2) одни клетки, но не другие, могут увеличивать размер своей популяции.Различия, присущие клеткам, в способности реагировать на MDI, в том, какими клетками они становятся, или комбинация вышеперечисленного может привести к наблюдаемому паттерну. Хотя размер субпопуляций изначально отличается, он изменяется только после индукции дифференцировки. Поскольку оценивались только доли каждой субпопуляции, а не их абсолютный размер, перегиб можно достичь либо путем дублирования реагирующих клеток, либо путем сокращения других.В самом деле, преадипоциты могут реплицироваться после индукции (Bernlohr et al., 1985). Зрелые адипоциты могут делить и перераспределять липидные капли между дочерними клетками (Nagayama et al., 2007).

Предыдущие исследования указали на гетерогенную природу культур клеток адипоцитов и предшественников жировой ткани. Часто эти исследования были сосредоточены на фенотипических и молекулярных различиях среди идентифицированных популяций. Большинство объясняет эти различия причинами двух категорий: асинхронная дифференциация и приверженность к родословной.Первый относится к клеткам, которые по существу похожи, но только дольше дифференцируются (Loo et al., 2009). Следовательно, в любой конкретный момент некоторые клетки не будут иметь характеристик зрелых адипоцитов. Например, клетки с низким содержанием липидов могут образовывать более крупные липидные капли просто путем длительного моделирования (Le and Cheng, 2009). Хотя наше исследование не исключает такой возможности, оно делает противоположные наблюдения. Во-первых, различия между субпопуляциями очевидны с самого начала (преадипоциты).Во-вторых, отстающие субпопуляции не обнаруживают никаких признаков дифференцировки ни в адипогенной регуляции, ни в синтезе липидов. Наконец, набор данных расширяется до 2 недель, что вдвое превышает период обычного созревания.

Исследования, основанные на клетках-предшественниках жировой ткани, предполагают, что некоторые клетки либо неспособны дифференцироваться в зрелые адипоциты, происходят из определенных депо, либо могут дифференцироваться только в адипоциты других типов (коричневые / бежевые). Одно исследование показало, что висцеральная, а не подкожная белая жировая ткань мыши возникает из клеток, экспрессирующих ген опухоли Вильмса ( Wt1 ) (Chau and Hastie, 2014).Другой обнаружил, что способность адипоцитов накапливать жир передается по наследству (Katz et al., 2014). Гистоновая модификация промотора PPARG помечает клетки, которые могут де-дифференцироваться и повторно дифференцироваться. Было даже показано, что подгруппа меньшинства, лишенная типичных характеристик адипоцитов, может брать на себя регулирующую роль, паракринно влияя на свое окружение (Schwalie et al., 2018).

Здесь мы предполагаем, что зрелые адипоциты возникают из меньшинства преадипоцитов. Большинство преадипоцитов не могут правильно дифференцироваться или накапливать липиды. Это отсутствие реакции на среду дифференциации связано со структурными ограничениями или связано с ними. Основными факторами, которые различают два типа клеток, являются гены, участвующие в клеточном цитоскелете и актиновых филаментах. Молекулярные различия также существуют, что наиболее важно в регуляции адипогенеза, синтеза липидов и передачи сигналов инсулина.

Это исследование было ограничено общедоступными данными по экспрессии генов модели клеток 3T3-L1 и первичных адипоцитов. Для определения роли отдельных белковых маркеров, их распределения в субпопуляциях и клеточных процессов, в которых они участвуют, требуется экспериментальная проверка.Например, может ли манипулирование белками, участвующими в организации клеточной структуры или внеклеточного матрикса, влиять на способность клетки дифференцироваться? Эти эксперименты следует проводить на отдельных клетках или разделять популяции на основе их способности к дифференцировке, что мы планируем сделать в будущих исследованиях.

Заявление о доступности данных

Данные, проанализированные в исследовании, размещены в Figshare, https://doi.org/10.6084/m9.figshare.9

2 и https://doi.org/10.6084 / m9.figshare.13088624.

Взносы авторов

MA задумал, выполнил и сообщил об анализе. TL помог с концептуализацией и написанием рукописи. DK получил финансирование, руководил и внес свой вклад в концепцию и написание рукописи. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Это исследование было поддержано грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым Министерством науки и ИКТ (MSIT) правительства Кореи (2015R1A5A2008833 и 2020R1A2C2011416).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все утверждения, выраженные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно отражают претензии их дочерних организаций или издателей, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или заявление, которое может быть сделано его производителем, не подлежат гарантии или одобрению со стороны издателя.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2021.753042/full#supplementary-material

Список литературы

Ахмед М. и Ким Д. Р. (2019). Моделирование экспрессии генов и связывания ДНК в дифференцирующихся адипоцитах 3T3-L1. Адипоцит 8, 401–411. DOI: 10.1080 / 21623945.2019.1697563

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ахмед, М., Мин, Д. С., Ким, Д. Р. (2020). Собранный набор данных по экспрессии генов дифференцирующих адипоцитов 3T3-L1 в условиях фармакологических и генетических нарушений. Адипоцит 9, 600–608. DOI: 10.1080 / 21623945.2020.1829852

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Аль-Адхами, Х. , Эвано, Б., Ле Дигарчер, А., Гейдан, К., Дюбуа, Э., Парринелло, Х. и др. (2015). Системный подход к родительскому геномному импринтингу: импринтированная генная сеть включает гены внеклеточного матрикса и регулирует выход из клеточного цикла и дифференцировку. Genome Res . 25, 353–367. DOI: 10.1101 / gr.175919.114

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эндрюс, С. (2020). FastQC: инструмент контроля качества для данных последовательности с высокой пропускной способностью.

Бернлор, Д. А., Болановски, М. А., Келли, Т. Дж., И Лейн, М. Д. (1985). Доказательства увеличения транскрипции специфических мРНК во время дифференцировки преадипоцитов 3T3-L1. J. Biol. Chem . 260, 5563–5567. DOI: 10.1016 / S0021-9258 (18) 89059-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бриер, А.С. Б., Лофт, А., Мадсен, Дж. Г., Розенгрен, Т., Нильсен, Р., Шмидт, С. Ф. и др. (2017). Семейство KDM5 необходимо для активации генов пролиферативного клеточного цикла во время дифференцировки адипоцитов. Nucleic Acids Res . 45, 1743–1759. DOI: 10.1093 / nar / gkw1156

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Brunmeir, R., Wu, J., Peng, X., Kim, S.Y., Julien, S.G., Zhang, Q., et al. (2016). Сравнительный транскриптомный и эпигеномный анализы выявили новые регуляторы коричневого адипогенеза у мышей. PLoS Genet . 12: e1006474. DOI: 10.1371 / journal.pgen.1006474

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бюхнер, Д. А., Шарриер, А., Сринивасан, Э., Ван, Л., Паульсен, М. Т., Юнгман, М., et al. (2015). Белок цинкового пальца 407 (ZFP407) регулирует инсулино-стимулированное поглощение глюкозы и мРНК транспортера глюкозы 4 (Glut4). J. Biol. Chem . 290, 6376–6386. DOI: 10.1074 / jbc.M114.623736

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Карлсон, М.(2020). org.Mm.eg.db: аннотация генома для человека.

Чаудхари Н., Гонсалес Э., Чанг С. Х., Гэн Ф., Рафии С. , Алторки Н. К. и др. (2016). Активация киназы PI3 аденовирусным белком E4-ORF1 выявляет дифференциальную регуляцию нижестоящих эффекторных путей в адипоцитах. Cell Rep . 17, 3305–3318. DOI: 10.1016 / j.celrep.2016.11.082

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен, Л. (2020). debCAM: Деконволюция выпуклым анализом смесей.

Чен X., Айяла И., Шеннон К., Фурко М., Ачарья Н. К., Дженкинсон К. П. и др. (2018). Ген диабета и эффектор пути wnt TCF7L2 регулируют развитие и функцию адипоцитов. Диабет 67, 554–568. DOI: 10.2337 / db17-0318

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Долатабади, С., Кандия, Дж., Акрап, Н., Ваннас, К., Томич, Т. Т., Лозерт, В. и др. (2017). Экспрессия гена, зависящая от клеточного цикла и размера клетки, выявляет различные субпопуляции на уровне одной клетки. Фронт. Генет . 8: 1. DOI: 10.3389 / fgene.2017.00001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Duteil, D. , Metzger, E., Willmann, D., Karagianni, P., Friedrichs, N., Greschik, H., et al. (2014). LSD1 способствует окислительному метаболизму белой жировой ткани. Nat. Коммуна . 5: 4093. DOI: 10.1038 / ncomms5093

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

Грин, Х., Кехинде, О. (1975). Установленная линия предадипозных клеток и ее дифференциация в культуре II.Факторы, влияющие на конверсию жировой ткани. Cell 5, 19–27. DOI: 10.1016 / 0092-8674 (75)

-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гилак, Ф., Коэн, Д. М., Эстес, Б. Т., Гимбл, Дж. М., Лидтке, В., и Чен, К. С. (2009). Контроль судьбы стволовых клеток путем физического взаимодействия с внеклеточным матриксом. Стволовая клетка . 5, 17–26. DOI: 10.1016 / j.stem.2009.06.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Херрингтон, Д.М., Мао, К., Паркер, С. Дж., Фу, З., Ю, Г., Чен, Л. и др. (2018). Протеомная архитектура атеросклероза коронарных сосудов и аорты человека. Тираж 137, 2741–2756. DOI: 10.1161 / CIRCULATIONAHA.118.034365

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сяо, А., Уорролл, Д. С., Олефски, Дж. М., и Субраманиам, С. (2004). Апостериорный вывод данных микроматрицы с моделированием дисперсии: обнаружение изменений экспрессии генов в адипоцитах 3T3-L1. Биоинформатика 20, 3108–3127.DOI: 10.1093 / биоинформатика / bth471

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хубер В., Кэри В. Дж., Джентльмен Р., Андерс С., Карлсон М., Карвалью Б. С. и др. (2015). Организация высокопроизводительного геномного анализа с помощью Bioconductor. Nat. Методы 12, 115–121. DOI: 10.1038 / nmeth.3252

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кац, Л.С., Герас-Раака, Э., и Гершенгорн, М.С. (2014). Наследственность накопления жира в белых адипоцитах. Am. J. Physiol. Эндокринол. Метабол . 307, E335-E344. DOI: 10.1152 / ajpendo. 00075.2014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кун А., Тху Д., Вальдфогель Х. Дж., Фаулл Р. Л. и Люти-Картер Р. (2011). Популяционно-специфический анализ экспрессии (PSEA) выявляет молекулярные изменения в больном мозге. Nat. Методы 8, 945–947. DOI: 10.1038 / Nmeth.1710

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, К.Ю., Луонг, К., Шарма, Р., Дрейфус, Дж. М., Уссар, С., и Кан, К. Р. (2019). Неоднородность развития и функциональная гетерогенность белых адипоцитов в пределах одного жирового депо. EMBO J . 38, 1–19. DOI: 10.15252 / embj.201899291

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лик, Дж. Т., Джонсон, У. Э., Паркер, Х. С., Фертиг, Э. Дж., Джаффе, А. Е., Стори, Дж. Д. и др. (2020). sva: анализ суррогатных переменных.

Google Scholar

Ляо, Ю., Смит, Г. К., и Ши, В. (2014). featureCounts: эффективная программа общего назначения для сопоставления считываний последовательностей с геномными функциями. Биоинформатика 30, 923–930. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btt656

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лим, Г. Э., Альбрехт, Т., Писке, М., Сараи, К., Ли, Дж. Т., Рамшоу, Х. С. и др. (2015). 14-3-3ζ координирует адипогенез висцерального жира. Nat. Коммуна . 6: 7671. DOI: 10.1038 / ncomms8671

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ло, К.А., Лабадорф, А., Кеннеди, Н. Дж., Хан, М. С., Яп, Ю. С., Мэтьюз, Б. и др. (2013). Анализ моделей инсулинорезистентности in vitro, и их физиологическое значение для in vivo , индуцированной диетой резистентности к инсулину жировой ткани. Cell Rep . 5, 259–270. DOI: 10.1016 / j.celrep.2013.08.039

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лу, Л. Х., Лин, Х. Дж., Сингх, Д. К., Лайонс, К. М., Альтшулер, С. Дж., И Ву, Л. Ф. (2009). Неоднородность физиологических состояний и фармакологических реакций дифференцирующихся преадипоцитов 3T3-L1. J. Cell Biol. . 187, 375–384. DOI: 10.1083 / jcb.2000

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Марони Г., Ткачук В. А., Егоров А., Морелли М. Дж., Луонго Р., Левантини Э. и др. (2017). Prep1 предотвращает преждевременный адипогенез мезенхимальных предшественников. Sci. Реп . 7, 15573. DOI: 10.1038 / s41598-017-15828-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нагаяма, М., Учида, Т., и Гохара, К.(2007). Временные и пространственные вариации липидных капель во время деления и дифференцировки адипоцитов. J. Lipid Res . 48, 9–18. DOI: 10.1194 / мл. M600155-JLR200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Nobusue, H., Onishi, N., Shimizu, T., Sugihara, E., Oki, Y., Sumikawa, Y., et al. (2014). Регуляция MKL1 посредством динамики актинового цитоскелета управляет дифференцировкой адипоцитов. Нет. Коммуна . 5: 3368. DOI: 10.1038 / ncomms4368

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Парк, Ю. -К., Ван, Л., Джампьетро, ​​А., Лай, Б., Ли, Ж.-Э. и Ге, К. (2017). Различная роль факторов транскрипции KLF4, Krox20 и рецептора γ, активируемого пролифератором пероксисом, в адипогенезе. Мол. Ячейка Биол . 37, 00554–00516. DOI: 10.1128 / MCB.00554-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пуль, А. С., Милтон, Ф. А., Цворо, А., Зиглафф, Д. Х., Кампос, Дж. К. Л., Бернардес, А., и др. (2015). Механизмы регуляции γ-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом, нестероидными противовоспалительными препаратами. Nucl. Прием. Сигнал 13: e004. DOI: 10.1621 / nrs.13004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

R Основная команда (2020). R: Язык и среда для статистических вычислений .

Google Scholar

Ричи, М. Э., Фипсон, Б., Ву, Д., Ху, Ю., Лоу, К. В., Ши, В. и др. (2015). Limma проводит анализ дифференциальной экспрессии для секвенирования РНК и исследований на микрочипах. Nucleic Acids Res . 43, е47.DOI: 10.1093 / nar / gkv007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рю, К. В., Нанду, Т., Ким, Дж., Чалла, С., ДеБерардини, Р. Дж., И Ли Краус, В. (2018). Метаболическая регуляция транскрипции посредством компартментализованного биосинтеза НАД +. Наука 360: eaan5780. DOI: 10.1126 / science.aan5780

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schwalie, P.C., Dong, H., Zachara, M., Russeil, J., Alpern, D., Akchiche, N., и другие. (2018). Популяция стромальных клеток, подавляющая адипогенез в жировых депо млекопитающих. Природа 559, 103–108. DOI: 10.1038 / s41586-018-0226-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шоу, Б., Ламберт, С., Вонг, М. Х. Т., Ральстон, Дж. К., Стриецки, К., и Матч, Д. М. (2013). Отдельные насыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты запускают различные транскрипционные сети в дифференцированных преадипоцитах 3T3-L1. J. Nutrigenet. Нутригеномика 6, 1–15.DOI: 10.1159 / 000345913

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Siersbk, R., Baek, S., Rabiee, A., Nielsen, R., Traynor, S., Clark, N., et al. (2014). Молекулярная архитектура горячих точек транскрипционных факторов в раннем адипогенезе. Cell Rep . 7, 1434–1442. DOI: 10.1016 / j.celrep.2014.04.043

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сирсбек, Р., Мадсен, Дж. Г. С., Хавьер, Б. М., Нильсен, Р., Багге, Э.K., Cairns, J., et al. (2017). Динамическое преобразование закрепленных за промотором петель хроматина во время дифференцировки адипоцитов. Мол. Ячейка . 66, 420–435. DOI: 10.1016 / j.molcel.2017.04.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Смит, К., Стукалин, Э., Кусума, С., Герехт, С., Сан, С. X. (2015). Стохастичность и пространственное взаимодействие определяют динамику дифференцировки стволовых клеток. Sci. Реп . 5, 1–10. DOI: 10.1038 / srep12617

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вербанк, М., Кануил, М., Лелуар, А., Деннин, В., Кумуль, X., Йенго, Л. и др. (2017). Воздействие низких доз бисфенолов A, F и S первичных адипоцитов человека влияет на профили кодирующих и некодирующих РНК. PLoS ONE 12: e0179583. DOI: 10.1371 / journal.pone.0179583

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wang, N., Hoffman, E.P, Chen, L., Chen, L., Zhang, Z., Liu, C., et al. (2016). Математическое моделирование транскрипционной гетерогенности позволяет идентифицировать новые маркеры и субпопуляции в сложных тканях. Sci. Реп . 6: 18909. DOI: 10.1038 / srep18909

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янг В., Го X., Тейн С., Сюй Ф., Суги С., Баас П. В. и др. (2013). Регуляция адипогенеза путем ремоделирования цитоскелета облегчается ацетилтрансферазой MEC-17-зависимым ацетилированием α-тубулина. Biochem. J . 449, 606–612. DOI: 10.1042 / BJ20121121

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ю, Д., Нильссон, Э., Тенен, Д. Э., Любецкая, А., Ло, Дж. К., Цзян, Р. и др. (2017). Dnmt3a — эпигенетический медиатор резистентности к инсулину жировой ткани. eLife 6: e30766. DOI: 10.7554 / eLife.30766.042

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Yu, G., Wang, L.-G., Han, Y., and He, Q.-Y. (2012). clusterProfiler: пакет R для сравнения биологических тем среди генных кластеров. OMICS 16, 284–287. DOI: 10.1089 / omi.2011.0118

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжао, X., Ян, Ю., Сунь, Б.Ф., Ши, Ю., Ян, X., Сяо, В. и др. (2014). FTO-зависимое деметилирование N6-метиладенозина регулирует сплайсинг мРНК и необходимо для адипогенеза. Ячейка Res . 24, 1403–1419. DOI: 10.1038 / cr.2014.151

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Непрерывный транспорт небольшой фракции холестерина плазматической мембраны в эндоплазматический ретикулум регулирует общий клеточный холестерин

Наше текущее понимание внутриклеточного транспорта холестерина стало возможным благодаря инструментам, которые ингибируют определенные этапы этого пути (см. Рисунок 9).Эти инструменты были обнаружены в результате изучения генетических нарушений или скрининга малых молекул. Клетки людей с семейной гиперхолестеринемией показали, как рецепторы ЛПНП обеспечивают поглощение богатых холестерином ЛПНП посредством процесса, называемого рецептор-опосредованным эндоцитозом (Brown and Goldstein, 1986). Клетки от людей с болезнью Вольмана или болезнью накопления холестериловых эфиров показали, как липаза лизосомальной кислоты превращает эфиры холестерина, высвобождаемые из эндоцитированных ЛПНП, в неэтерифицированный холестерин, форму, которая может использоваться клетками (Brown et al., 1976; Гольдштейн и др., 1975; Слоан и Фредриксон, 1972; Wolman et al., 1961). Активность лизосомальной кислой липазы и другие процессы деградации лизосом также блокируются хлорохином (Goldstein et al., 1975). Клетки людей с болезнью Ниманна-Пика C показали, как два лизосомных белка, NPC1 и NPC2, перемещают неэстерифицированный холестерин, вырабатываемый липазой лизосомальной кислоты, из лизосом (Carstea et al. , 1997; Kwon et al., 2009; Liscum and Faust, 1987; Наурецкене и др., 2000).Этот последний шаг также блокируется U18666A, катионным амфифилом, который связывается с NPC1 и ингибирует транспорт холестерина из лизосом (Cenedella, 2009; Liscum and Faust, 1989; Lu et al., 2015). Несмотря на эти достижения, мало что известно о том, как холестерин перемещается к другим органеллам после выхода из лизосомы. Текущее исследование представляет ALOD4 в качестве нового ингибитора для понимания этапов постлизосомального транспорта холестерина.

Модель внутриклеточного маршрута холестерина, производного от ЛПНП.

( А ) Нормальный оборот. Частицы ЛПНП, содержащие сложные эфиры холестерина, интернализуются истощенными стеролами клетками через рецептор-опосредованный эндоцитоз. Интернализованные ЛПНП расщепляются в лизосомах, а его холестериловые эфиры (холестериновые эфиры) гидролизуются кислой липазой с образованием неэтерифицированного холестерина ( желтые кружки, ) и жирных кислот. Два лизосомных белка, NPC1 и NPC2, опосредуют выход холестерина ЛПНП из лизосом.Холестерин сначала транспортируется к обедненным стеролами PM, чтобы восполнить его холестерин до тех пор, пока не будут достигнуты оптимальные уровни. Избыточный холестерин PM затем перемещается в регионы ER, где расположена регуляторная сеть SREBP и где уровни холестерина ниже пороговой концентрации. После повышения уровня холестерина ER выше порогового уровня избыточный холестерин связывается с SCAP, датчиком холестерина ER, который находится в комплексах с SREBP. Связывание с холестерином изменяет конформацию Scap, способствуя его взаимодействию с Insigs, белками, удерживающими ER, и предотвращая рекрутирование комплекса Scap-SREBP в везикулы CopII для транспортировки к Гольджи.Протеолитическая активация SREBP в Golgi не происходит, и гены, кодирующие ферменты синтеза и поглощения холестерина, отключаются, таким образом поддерживая гомеостаз холестерина. Избыточный холестерин ER может транспортироваться к PM или может быть преобразован ACAT, ферментом ER, в сложные эфиры холестерина и сохранен во внутриклеточных липидных каплях. ( B ) Генетические нарушения или сконструированные инструменты, которые препятствуют передаче холестерина ЛПНП на различных этапах его маршрута. См. Обсуждение для описания каждого из обесценений.

https://doi.org/10.7554/eLife.25466.011

ALOD4 представляет собой нелитический пептид, полученный из бактериального токсина, который связывается с доступным холестерином в мембранах (Gay et al., 2015). Другие версии этих токсинов использовались в анализах конечных точек для измерения изменений доступного холестерина в мембранах PM и ER, очищенных из культивированных клеток (Das et al., 2014; Sokolov and Radhakrishnan, 2010). Эти более ранние исследования показали, что распределение холестерина между недоступными и доступными пулами в мембранах PM и ER играет решающую роль в контроле клеточных уровней холестерина.В текущем исследовании живых клеток мы обнаружили, что ALOD4 делает гораздо больше, чем просто служит пассивным репортером доступности холестерина PM. При добавлении во внеклеточную среду клеток, которые были переполнены холестерином, ALOD4 быстро связывал холестерин PM и предотвращал его перемещение в ER. В результате уровни холестерина ER упали ниже пороговой концентрации ~ 5 мол.% Холестерина, тем самым запуская активацию факторов транскрипции SREBP (рис. 2–5). ALOD4 не связывался с PM клеток, лишенных холестерина (Фигуры 6A и 8).Когда мы попытались восполнить истощенные стерол клетки комплексами MCD / холестерин, которые доставляют холестерин непосредственно к PM, ALOD4 немедленно связал этот вновь доставленный холестерин в PM и предотвратил его перемещение в ER для подавления активации SREBP2 (Рисунок 8). Потенциально полезная особенность ALOD4 заключается в том, что путем секвестрации холестерина PM без извлечения его из мембраны, холестерин ER истощается, даже если уровни холестерина PM и общие уровни клеточного холестерина не изменяются (рисунки 2D и 5).Эта секвестрация обратима, поскольку удаление ALOD4 из среды приводит к быстрой диссоциации связанного с PM ALOD4 (рис. 4D – E) и восстановлению транспорта холестерина из PM в ER (рис. 7C). Напротив, другие модуляторы холестерина, такие как циклодекстрины, статины или сыворотка с низким содержанием липопротеинов, необратимо истощают холестерин как мембран PM, так и ER (Das et al., 2014, 2013; Radhakrishnan et al., 2008).

Специфическое ингибирование

ALOD4 транспорта холестерина из PM в ER позволило нам прояснить путь доставки холестерина, полученного из ЛПНП, после того, как он выходит из лизосом.Постлизосомная судьба холестерина, полученного из ЛПНП, является предметом дискуссий, и некоторые исследования предполагают, что он перемещается из лизосом в PM (Das et al., 2014; Lange and Steck, 1997; Xu and Tabas, 1991) и др. исследования, предполагающие, что он перемещается из лизосом в ER (Neufeld et al., 1996; Underwood et al., 1998). В присутствии ALOD4 истощенные стеролом клетки интернализовали ЛПНП и расщепляли его в лизосомах (рис. 6С), а холестерин, полученный из ЛПНП, выходил из лизосом и достигал ПМ (рис. 6А).В PM ALOD4 секвестрировал холестерин, полученный из ЛПНП, предотвращая его перемещение в ER и подавляя активацию SREBP2 (Рисунок 6A) или стимулируя активность ACAT (Рисунок 6B). Эти данные подтверждают модель, согласно которой холестерин, полученный из ЛПНП, сначала перемещается из лизосом в ТЧ (рис. 9). Только после того, как потребности PM в холестерине удовлетворены, избыток холестерина перемещается из PM в ER. Холестерин, производный от ЛПНП из лизосом, не может обходить PM и перемещаться непосредственно в ER, чтобы отключить липогенные гены, тем самым гарантируя, что поставка холестерина не будет преждевременно прекращена до того, как потребности PM будут удовлетворены.Наша упрощенная модель показывает, что холестерин, полученный из ЛПНП, перемещается непосредственно из лизосом в PM (рис.9), но мы не можем исключить возможность того, что этот холестерин останавливается на промежуточных остановках в других органеллах, таких как пероксисомы, на пути к PM (Chu et al., 2015 ), пока эти остановки не включают область ER, в которой находится регуляторная сеть SREBP или фермент ACAT. Маршрут транспортировки холестерина из PM в ER может также включать остановки на других органеллах. Следует отметить, что холестерин, полученный из ЛПНП, наиболее вероятно доставляется к цитоплазматической створке ПМ, но затем должен переместиться на внешний створок ПМ, чтобы быть доступным для связывания с внеклеточно добавленным ALOD4.Этот шаг, вероятно, не ограничивает скорость, поскольку предыдущие исследования показали, что уравновешивание холестерина между двухслойными листочками мембран эритроцитов происходит быстро (t 1/2 ~ 1 с) (Steck et al., 2002).

Кинетические исследования на рисунке 4 позволили нам оценить количество молекул холестерина, которые должны быть секвестрированы в PM, чтобы запустить транспорт SREBP от ER к Golgi и протеолитическую активацию. При насыщении ~ 150 нг (~ 10 пмоль) ALOD4 связывается с ~ 120 000 клеток в одной лунке 48-луночного планшета (рис. 4C).Если мы предположим, что каждая молекула ALOD4 секвестрирует одну молекулу холестерина, мы рассчитаем, что ALOD4 связывает ~ 0,08 фмоль холестерина на клетку. В более раннем исследовании мы подсчитали, что клетка CHO-K1, растущая в богатой липопротеинами FCS, содержит ~ 10 фмоль холестерина (Radhakrishnan et al., 2008). Консорциум LIPID MAPS провел количественную оценку липидома макрофага мыши и сообщил, что клетка макрофага содержит 1000–2000 пмоль холестерина / мкг ДНК (Dennis et al., 2010). Используя это значение и предыдущие измерения ~ 10 пикограммов ДНК / клетка мыши (Collins, 1978; Collins et al., 1980), мы подсчитали, что макрофаг мыши содержит ~ 10–20 фмоль холестерина, что аналогично расчетному значению для клеток CHO-K1. Принимая во внимание многие допущения, сделанные при оценке этих значений, наши результаты показывают, что секвестирование лишь небольшой части (~ 1%) клеточного холестерина в PM и предотвращение его движения в ER может вызвать активацию SREBPs в целом или -не манерой. Лечение HPCD, обычно используемым инструментом для изучения регуляции холестерина, снижает клеточный холестерин на 30-40%, а также запускает активацию SREBP (Рисунки 3C и 5). Результаты, полученные с помощью ALOD4, показывают, что гомеостатический механизм холестерина чувствителен к гораздо более тонким изменениям в небольшой, лабильной фракции холестерина PM. Остается определить, представляет ли эта небольшая фракция критический суб-пул ранее определенного пула доступного PM холестерина (~ 15 мол.% Липидов PM, Das et al., 2014). Эта метаболически активная фракция холестерина PM может поддерживаться даже в клетках с дефицитом NPC1, которые не могут использовать ЛПНП в качестве источника холестерина и должны полагаться на биосинтез холестерина для обеспечения своих PM с оптимальными уровнями холестерина.Как показано на фиг. 7B, ALOD4 запускал активацию SREBP2 в NPC1-дефицитных клетках с такой же концентрационной зависимостью, как и в контрольных клетках.

В клетках, изобилующих холестерином, устойчивый транспорт холестерина из PM в ER гарантирует, что концентрация холестерина в ER превышает пороговое значение в 5 мол.% Липидов ER (Radhakrishnan et al. , 2008). При этих высоких концентрациях холестерин связывается с Scap сенсора холестерина ER, что приводит к образованию комплекса с резидентными Insigs ER, предотвращая рекрутирование Scap в покрытые CopII везикулы и транспортировку SREBP к Гольджи, где они могут быть протеолитически активированы (рис. 9A). .Инкубация этих насыщенных холестерином клеток с ALOD4 в течение 1 часа в присутствии компактина, ингибитора синтеза холестерина, приводит к падению холестерина ER ниже пороговой концентрации 5 мол.% (Рис. 5). Это падение концентрации холестерина приводит к диссоциации холестерина от Scap, разборке комплекса Scap-Insig и способствует рекрутированию Scap в покрытые CopII везикулы для транспорта и активации SREBP (рис. 9B). Как ALOD4 вызывает падение уровня холестерина ER без изменения общего клеточного холестерина? В отсутствие синтеза холестерин ER поддерживается на равновесном уровне за счет уравновешивания притока холестерина из PM с оттоком холестерина из ER в другие органеллы, в том числе в PM (Lange et al. , 2004, Дас и др., 2014). Ингибирование ALOD4 пути притока, но не пути оттока, нарушает это равновесие и приводит к падению холестерина ER ниже пороговой концентрации 5 мол.%, Даже если холестерин не был удален из PM (рис. 5). Это говорит о том, что, когда клетки изобилуют холестерином, ER непрерывно получает холестерин от PM, чтобы компенсировать потери холестерина из-за оттока из ER. Это позволяет ER постоянно отбирать образцы содержания холестерина в PM и вносить корректировки посредством транскрипционной регуляции поглощения и синтеза холестерина для обеспечения оптимальных уровней холестерина PM.Как холестерин перемещается от PM к ER в настоящее время неясно, хотя были задействованы белки PM, такие как ABCA1, а также везикулярные и невезикулярные пути переноса (Holthuis and Menon, 2014; Lahiri et al., 2015; Mesmin and Maxfield, 2009; Ямаути и др., 2015).

В экспериментах, в которых мы выяснили путь доставки холестерина, полученного из ЛПНП, мы целенаправленно включили компактин для устранения биосинтеза в качестве источника холестерина PM. Это позволило нам определить, что холестерин, полученный из ЛПНП, после высвобождения из лизосом, сначала направляется в ПМ, чтобы обеспечить оптимальные уровни холестерина в этой мембране, прежде чем расширять регуляторный пул ЭР для подавления синтеза и поглощения холестерина.Подобная стратегия, вероятно, используется для вновь синтезированного холестерина в ER, который также должен быть сначала направлен в PM, чтобы удовлетворить потребности этой мембраны, прежде чем расширять регуляторный пул ER, чтобы остановить синтез и поглощение холестерина. Как белки, участвующие в синтезе, регуляции и этерификации холестерина, пространственно организованы в ER и как холестерин перемещается из ER в PM, в настоящее время неизвестно. В дополнение к использованию, описанному в текущем исследовании, ALOD4 также может помочь выявить транспортные пути, которые исходят из ER и доставляют холестерин в PM.

Небольшая фракция ядер конденсации морских облаков, состоящая из аэрозолей из морских брызг

  • 1

    Warneck, P. Chemistry of the Natural Atmosphere (San Diego Academic, 1988).

    Google ученый

  • 2

    Макиннес, Л. М., Куинн, П. К., Коверт, Д. С. и Андерсон, Т. Л. Гравиметрический анализ, ионный состав и связанная с ним водная масса морского аэрозоля. Атмос. Environ. 30 , 869–884 (1996).

    Артикул Google ученый

  • 3

    Куинн, П. К. и Коффман, Д. Дж. Локальное закрытие во время ACE 1: массовая концентрация аэрозоля и коэффициенты рассеяния и обратного рассеяния. J. Geophys. Res. 103 , 16575–16596 (1998).

    Артикул Google ученый

  • 4

    Куинн, П. К. и Коффман, Д. Дж. Комментарий на «Вклад различных видов аэрозолей в оптическую толщину глобального затухания аэрозолей: оценки по результатам моделирования» Тегена и др. . J. Geophys. Res. 104 , 4241–4248 (1999).

    Артикул Google ученый

  • 5

    Якобсон, М.З. Глобальное прямое радиационное воздействие, вызванное многокомпонентными антропогенными и естественными аэрозолями. J. Geophys. Res. 106 , 1551–1568 (2001).

    Артикул Google ученый

  • 6

    Takemura, T. et al. Альбедо однократного рассеяния и радиационное воздействие различных видов аэрозолей с глобальной трехмерной моделью. J. Clim. 15 , 333–352 (2002).

    Артикул Google ученый

  • 7

    de Leeuw, G. et al. Производственный флюс морского аэрозоля. Rev. Geophys. 49 , RG2001 (2011).

    Артикул Google ученый

  • 8

    Ovadnevaite, J. et al. Параметризация потока аэрозолей в виде морских брызг, инкапсулирующая волновое состояние. Атмос. Chem.Phys. 14 , 1837–1852 (2014).

    Артикул Google ученый

  • 9

    Цигаридис, К., Кох, Д. и Менон, С. Неопределенности и важность состава морских брызг для прямого и косвенного воздействия аэрозолей. J. Geophys. Res. 118 , 220–235 (2013).

    Google ученый

  • 10

    O’Dowd, C.D. et al. Биогенный вклад органических веществ в морской аэрозоль. Nature 431 , 676–680 (2004).

    Артикул Google ученый

  • 11

    Лек, К. и Бигг, Э. К. Биогенные частицы в поверхностном микрослое и наложенной атмосфере в центральной части Северного Ледовитого океана летом. Tellus B 57 , 305–316 (2005).

    Артикул Google ученый

  • 12

    Keene, W. C. et al. Химические и физические характеристики образующихся аэрозолей, образующихся при лопании пузырьков на модельной границе раздела воздух-море. J. Geophys. Res. 112 , D21202 (2007).

    Артикул Google ученый

  • 13

    Facchini, M.C. et al. Важный источник морского вторичного органического аэрозоля из биогенных аминов. Environ. Sci. Technol. 42 , 9116–9121 (2008).

    Артикул Google ученый

  • 14

    Куинн П. К. и Бейтс Т. С. Дело против регулирования климата через выбросы серы из океанического фитопланктона. Nat. Geosci. 480 , 51–56 (2011).

    Google ученый

  • 15

    Campuzano-Jost, P. et al. Измерение аэрозолей морской соли в режиме реального времени во время кампании SEAS: сравнение обнаружения натрия на основе выбросов с методом определения летучести аэрозолей. J. Atmos. Ocean Tech. 20 , 1421–1430 (2003).

    Артикул Google ученый

  • 16

    Хоббс П. V. Одновременные воздушные измерения ядер облачной конденсации и натрийсодержащих частиц над океаном. Q. J. R. Meteorol. Soc. 97 , 263–271 (1971).

    Артикул Google ученый

  • 17

    Макиннес, Л. М., Коверт, Д. С. и Бейкер, Б. Количество морской соли, сульфатов и углеродистых частиц в морской атмосфере: измерения ЭМ согласуются с распределением по размерам в окружающей среде. Tellus B 49 , 300–313 (1997).

    Артикул Google ученый

  • 18

    Мерфи, Д. М. и др. Влияние морской соли на радиационные свойства аэрозолей в морском пограничном слое Южного океана. Nature 392 , 62–65 (1998).

    Артикул Google ученый

  • 19

    Динджер, Дж. Э., Хауэлл, Х. Б. и Войцеховски, Т. А. Об источнике и составе ядер облаков в оседающей воздушной массе над Северной Атлантикой. J. Atmos. Sci. 27 , 791–797 (1970).

    Артикул Google ученый

  • 20

    О’Дауд, К. Д., Смит, М. Х. и Дженнингс, С. Г. Характеристики углерода субмикронных частиц, радона и сажи над северо-восточной Атлантикой. J. Geophys. Res. 98 , 1123–1135 (2003).

    Артикул Google ученый

  • 21

    Modini, R. L. et al.Первичные взаимодействия морского аэрозоля и облака у побережья Калифорнии. J. Geophys. Res. 120 , 4282–4303 (2015).

    Google ученый

  • 22

    Льюис, Э. Р. и Шварц, С. Э. Производство аэрозолей морской соли: механизмы, методы, измерения и модели — критический обзор (Американский геофизический союз, 2004).

    Google ученый

  • 23

    Пратер, К.A. et al. Перенести океан в лабораторию, чтобы исследовать химический состав аэрозолей в виде морских брызг. Proc. Natl Acad. Sci. США 110 , 7550–7555 (2013).

    Артикул Google ученый

  • 24

    Спил Д. Э. О рождении пленочных капель из пузырьков, лопающихся на поверхности морской воды. J. Geophys. Res. 103 , 24907–24918 (1998).

    Артикул Google ученый

  • 25

    Бикерман, Дж.J. Пены (Springer, 1973).

    Книга Google ученый

  • 26

    Фейнголд Г., Коттон У. Р., Крейденвейс, С. М. и Дэвис, Дж. Т. Влияние гигантских ядер конденсации облаков на образование мороси в слоисто-кучевых облаках: последствия для радиационных свойств облаков. J. Atmos. Sci. 56 , 4100–4117 (1998).

    Артикул Google ученый

  • 27

    Бейтс Т.S. et al. Процессы, контролирующие распределение аэрозольных частиц в нижнем пограничном слое моря во время Первого эксперимента по определению характеристик аэрозоля (ACE 1). J. Geophys. Res. 103 , 16369–16383 (1998).

    Артикул Google ученый

  • 28

    Коверт, Д. С., Капустин, В. Н., Бейтс, Т. С. и Куинн, П. К. Физические свойства аэрозольных частиц морского пограничного слоя в средней части Тихого океана по отношению к источникам и метеорологическому переносу. J. Geophys. Res. 101 , 6919–6930 (1996).

    Артикул Google ученый

  • 29

    Куинн, П. К., Капустин, В. Н., Бейтс, Т. С. и Коверт, Д. С. Химические и оптические свойства аэрозольных частиц морского пограничного слоя в средней части Тихого океана по отношению к источникам и метеорологическому переносу. J. Geophys. Res. 101 , 6931–6951 (1996).

    Артикул Google ученый

  • 30

    Кларк, А.и другие. Производство частиц в удаленной морской атмосфере: отток и оседание облаков во время ACE-1. J. Geophys. Res. 103 , 16397–16409 (1998).

    Артикул Google ученый

  • 31

    Раес, Ф. Унос аэрозолей в свободной тропосфере как регулирующий механизм ядер конденсации облаков в удаленном морском пограничном слое. J. Geophys. Res. 100 , 2893–2903 (1995).

    Артикул Google ученый

  • 32

    Кларк, А.Атмосферные ядра в средней тропосфере Тихого океана: их природа, концентрация и эволюция. J. Geophys. Res. 98 , 20633–20647 (1993).

    Артикул Google ученый

  • 33

    Бигг, Э. К., Лек, К. и Нильссон, Э. Д. Внезапные изменения концентрации аэрозолей в атмосфере Арктики летом и осенью. Tellus B 48 , 254–271 (1996).

    Артикул Google ученый

  • 34

    Гра, Дж.L. Постфронтальные наночастицы на мысе Грим: влияние на концентрацию ядер облаков. Environ. Chem. 6 , 515–523 (2009).

    Артикул Google ученый

  • 35

    Гра, Дж. Л., Джими, С. И., Симс, С. Т. и Краммель, П. Б. Постфронтальные наночастицы на мысе Грим: наблюдения. Environ. Chem. 6 , 508–514 (2009).

    Артикул Google ученый

  • 36

    Хегг Д.А., Коверт, Д. С., Капустин, В. Н. Моделирование случая зарождения частиц в морском пограничном слое. J. Geophys. Res. 97 , 9851–9857 (1992).

    Артикул Google ученый

  • 37

    Хоппель, У. А., Фрик, Г. М., Фицджеральд, Дж. У. и Ларсон, Р. Е. Измерения образования новых частиц в морском пограничном слое и влияние неосаждающих облаков на распределение аэрозольных частиц по размерам. Дж.Geophys. Res. 99 , 14443–14459 (1994).

    Артикул Google ученый

  • 38

    Frossard, A. A. et al. Весенняя арктическая дымка — вклад субмикронных органических частиц из европейских и азиатских источников горения. J. Geophys. Res. 116 , D05205 ​​(2011).

    Артикул Google ученый

  • 39

    Tunved, P., Strom, J. & Krejci, R.Жизненный цикл арктических аэрозолей: увязка распределения размеров аэрозолей, наблюдавшихся в период с 2000 по 2010 год, с переносом воздушных масс и осадками на станции Цеппелин, Ню-Олесунн, Шпицберген. Атмос. Chem. Phys. 13 , 3643–3660 (2013).

    Артикул Google ученый

  • 40

    Leaitch, W. R. et al. Диметилсульфид контроль за чистыми летними арктическими аэрозолями и облаками. Элем. Sci. Anth. 1 , 17 (2013).

    Артикул Google ученый

  • 41

    Фитцджеральд, Дж. У. Измерение зависимости между размером сухого вещества и критическим перенасыщением природных аэрозольных частиц. J. Appl. Meteorol. 14 , 1044–1049 (1975).

    Артикул Google ученый

  • 42

    Хоппель, У. А., Фрик, Г. М. и Фицджеральд, Дж. У. Вычисление концентрации капель и перенасыщения в облаках морского пограничного слоя на основе измерений приземных аэрозолей. J. Geophys. Res. 101 , 26553–26565 (1996).

    Артикул Google ученый

  • 43

    Leaitch, W. R. et al. Физические и химические наблюдения в морских слоях во время Североатлантического регионального эксперимента 1993 года: факторы, контролирующие концентрацию количества облачных капель. J. Geophys. Res. 101 , 29123–29135 (1996).

    Артикул Google ученый

  • 44

    Хадсон, Дж.G. et al. Ядра конденсации облаков и следы кораблей. J. Atmos. Sci. 57 , 2696–2706 (2000).

    Артикул Google ученый

  • 45

    Робертс Г., Маугер Г., Хэдли О. и Раманатан В. Североамериканские и азиатские аэрозоли над восточной частью Тихого океана и их роль в регулировании ядер облачной конденсации. J. Geophys. Res. 111 , D13205 (2006).

    Артикул Google ученый

  • 46

    Хадсон, Дж.Г., Нобл, С. и Джа, В. Пересыщение облаков Стратуса. Geophys. Res. Lett. 37 , L21813 (2010).

    Артикул Google ученый

  • 47

    Коверт, Д. С., Капустин, В. Н., Куинн, П. К. и Бейтс, Т. С. Образование новых частиц в морском пограничном слое. J. Geophys. Res. 97 , 20581–20589 (1992).

    Артикул Google ученый

  • 48

    Хоффманн, Э.H. et al. Расширенное исследование на основе моделирования воздействий и атмосферных последствий многофазного химического состава диметилсульфида. Proc. Natl Acad. Sci. США 113 , 11776–11781 (2016).

    Артикул Google ученый

  • 49

    Калхун, Дж. А., Бейтс, Т. С. и Чарлсон, Р. Дж. Измерения изотопов серы субмикронных частиц сульфатного аэрозоля над Тихим океаном. Geophys. Res. Lett. 18 , 1877–1880 (1991).

    Артикул Google ученый

  • 50

    Norman, A. et al. Источники сульфата аэрозоля в Alert: распределение с использованием стабильных изотопов. J. Geophys. Res. 104 , 11619–11631 (1999).

    Артикул Google ученый

  • 51

    Берроуз, С. М., Хуз, К., Пошл, У. и Лоуренс, М. Г. Ядра льда в морском воздухе: биогенные частицы или пыль? Атмос.Chem. Phys. 13 , 245–267 (2013).

    Артикул Google ученый

  • 52

    Bates, TS, Coffman, DJ, Covert, DS & Quinn, PK Распределение размеров аэрозолей в морском пограничном слое в Индийском, Атлантическом и Тихом океанах: сравнение измерений INDOEX с ACE-1 и ACE-2, и аэрозоли 99. J. Geophys. Res. 107 , 8026 (2002).

    Артикул Google ученый

  • 53

    Куинн, П.K. et al. Оптические свойства аэрозоля в морском пограничном слое во время первого эксперимента по определению характеристик аэрозоля (ACE-1) и основные химические и физические свойства аэрозоля. J. Geophys. Res. 103 , 16547–16563 (1998).

    Артикул Google ученый

  • 54

    Рассел, Л. М. и др. Углеводный состав субмикронных атмосферных частиц и их образование в результате разрыва океанских пузырей. Proc. Natl Acad. Sci. США 107 , 6652–6657 (2010).

    Артикул Google ученый

  • 55

    Quinn, P. K. et al. Вклад углеродного пула на поверхности моря в обогащение органических веществ в аэрозольных брызгах моря. Nat. Geosci. 7 , 228–232 (2014).

    Артикул Google ученый

  • 56

    Berner, A. et al. Распределение размеров городского аэрозоля в Вене. Sci. Tot. Environ. 13 , 245–261 (1979).

    Артикул Google ученый

  • 57

    Холланд, Дж. Д. Химия атмосферы и океанов (Джон Вили, 1978).

    Google ученый

  • 58

    Терпин, Б. Дж. И Лим, Х.-Дж. Вклад видов в массовые концентрации PM2,5: пересмотр общих допущений для оценки органической массы. Aerosol Sci. Tech. 35 , 602–610 (2001).

    Артикул Google ученый

  • 59

    Винклмайер, В., Райшл, Г. П., Линднер, А. О. и Бернер, А. Новый электромобильный спектрометр для измерения распределения размеров аэрозолей в диапазоне размеров от 1 до 1000 нм. J. Aerosol Sci. 22 , 289–296 (1991).

    Артикул Google ученый

  • 60

    Бейтс Т.S. et al. Перенос пыли и загрязнений в морском пограничном слое, связанный с прохождением фронтальной системы над Восточной Азией. J. Geophys. Res. 109 , Д19С19 (2004 г.).

    Артикул Google ученый

  • 61

    Stratmann, F. & Wiedensohler, A. Новый алгоритм инверсии данных для измерений DMPS. J. Aerosol Sci. 27 , 339–340 (1997).

    Артикул Google ученый

  • 62

    Лэнс, С., Медина, Дж., Смит, Дж. Н. и Ненес, А. Отображение работы счетчика CCN непрерывного потока DMT. Aerosol Sci. Tech. 40 , 242–254 (2006).

    Артикул Google ученый

  • 63

    Roberts, G. & Nenes, A. Камера CCN с непрерывным потоком, продольным градиентом температуры, для атмосферных измерений. Aerosol Sci. Tech. 39 , 206–221 (2005).

    Артикул Google ученый

  • 64

    Whittlestone, S.И Захоровски, В. Базовые детекторы радона для использования на борту судов: разработка и внедрение в Первом эксперименте по определению характеристик аэрозолей (ACE-1). J. Geophys. Res. 103 , 16743–16751 (1998).

    Артикул Google ученый

  • 65

    Rose, D. et al. Неопределенности калибровки и измерения счетчика ядер конденсации в непрерывном потоке (DMT-CCNC): активация CCN аэрозольных частиц сульфата аммония и хлорида натрия в теории и эксперименте. Атмос. Chem. Phys. 8 , 1153–1179 (2008).

    Артикул Google ученый

  • Массовые расстрелы составляют мизерную долю всех смертей от перестрелок

    В последние годы произошла серия широко разрекламированных массовых расстрелов. Но эти инциденты, хотя и трагичны, представляют собой крохотную частичку проблемы убийств с применением огнестрельного оружия в Америке. Мэры против незаконного оружия, анализируя данные ФБР, обнаружили, что менее 1 процента жертв убийств в 2010 году были убиты в результате инцидентов, в результате которых погибли четыре или более человек.

    Отчет Исследовательской службы Конгресса США (CRS) за 2013 год выявил 78 «публичных массовых расстрелов» в период с 1983 по 2012 год, в результате которых погибло 547 человек. Для сравнения, только в 2012 году в результате убийств с применением огнестрельного оружия погибло 11 622 человека (более чем в 20 раз больше, чем число массовых расстрелов за три десятилетия), а количество убийств в целом сокращается, поэтому в 1980-х и 90-х годах их число было выше. «Несмотря на то, что это трагично и шокирующе, публичные массовые расстрелы являются причиной немногих убийств или убийств по небрежности, связанных с огнестрельным оружием, которые ежегодно происходят в Соединенных Штатах», — заключил CRS.

    Некоторые исследования показывают, что массовые расстрелы, вопреки распространенному мнению, довольно стабильны во времени. Джеймс Алан Фокс, криминолог из Северо-Восточного университета, обнаружил, что количество жертв массовых расстрелов, преступников и инцидентов не сильно изменилось с 1980 по 2014 год:

    Джеймс Алан Фокс

    Fox использует довольно прямое определение массовых расстрелов как перестрелки, в которых погибают не менее четырех человек, и не обнаружил статистически значимого увеличения количества таких инцидентов или общего числа жертв.

    Другие исследователи, такие как Марк Фоллман из Матери Джонс и Эми П. Коэн из Гарвардской школы общественного здравоохранения, Дебора Азраэль и Мэтью Миллер, используют более ограничительное определение, исключая убийства, связанные с насилием в семье, наркотиками или бандитскими группировками. Используя данные, собранные Фоллманом и Матерью Джонс, в 2014 году исследователи из Гарварда пришли к выводу, что время между массовыми расстрелами сокращается:

    Vox использует еще одно определение, то есть случаи, когда четыре или более человека застрелены, но не обязательно убиты.Приведенные там данные не позволяют сделать однозначных выводов о том, растет ли ставка или остается стабильной.

    Определение «правильного» определения в подобных случаях не имеет большого значения для дебатов о контроле над оружием. Лучший вариант контроля над огнестрельным оружием — это самоубийства, а не массовые расстрелы. Но определение «борьба» имеет значение для идеологической войны через посредников. Объявление правых Фокса, Коэна и других имеет определенное политическое значение в более широких дебатах о контроле над оружием. Анализ Фокса, кажется, опровергает либеральные опасения по поводу увеличения количества массовых расстрелов; Коэн и др., Похоже, подтверждают эти опасения.

    Вы видите нечто подобное в дискуссиях о стрельбе в школах, в которых скептики в области контроля над огнестрельным оружием столь же стремятся заявить, что стрельба в школах, связанная с бандами, не является настоящими школьными стрельбами, как и принять определение Фокса, в котором массовые расстрелы, связанные с бандами , являются реальных массовых расстрелов — и наоборот для сторонников контроля над оружием.

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *