Иж 43 кн 510 отзывы: Ружью ИЖ-43 / 510 посвящается | Охотник выходного дня

Содержание

отзывы, цена, технические характеристики, обзор

МР-43 КН – модель из линейки МР-43. Относится к курковым гладкоствольным винтовкам, в которых возможна смена дульного сужения. Выпускается с разной длиной стволов, что лишь увеличивает ее популярность.

Гладкоствольные «горизонталки» выпускаются Ижевским механическим заводом уже более 55 лет. Надежная конструкция, безотказная работа и прекрасные показатели боя обеспечивают неизменную популярность изделию. МР-43 КН – единственное в России курковое двуствольное ружье, которое производится серийно.

Обзор ружья МР-43 КН

МР-43 КН или Иж-43, как их называли раньше – классическое охотничье ружье с горизонтально расположенными стволами и наружными курками. Эта особенность, а также накладные доски придают модели неповторимое очарование старины. После того как в 1990 г тульская курковая винтовка ТОЗ-80 была снята с производства, МР-43 КН остается единственным вариантом классической охотничьей модели.

Споры о качествах курковых и бескурковых двустволок не утихали никогда. Но после исчезновения даже возможности сравнивать, оказалось, что «курковка» востребована до сих пор и вовсе не из-за оригинального внешнего вида.

МР-43 КН по сравнению со своим предшественником имеет определенные конструкционные отличия. В частности, установлен ударно-спусковой механизм, который не допускает выстрела без полного выжима спускового крючка. Безопасности изделия уделено максимум внимания: сама конструкция наружных курков не разрешает осуществить выстрел при внешнем ударе по курку.

Выпускается несколько модификаций изделия. Наибольший интерес среди охотников вызывает модель с экстремально укороченным стволом – для охоты на перепелов. 10 лет назад, когда появилась двустволка МР-43 КН, это была настоящая революция на российском рынке.

Какие имеет двуствольное курковое ружье МР-43KH недостатки, расскажем далее.

Обзор ружья МР-43 КН дан в этом видео:

Разборка

Для ухода за винтовкой периодически проводят процедуру неполной разборки. Порядок действий таков:

  • осматривают патронник на наличие патронов. Изымают их;
  • оттягивают защелку цевья на нижней его поверхности и поворачивают передний конец цевья от ствола. Отсоединяют цевье;
  • поворачивают рычаг запора в верхней части коробки вправо. Поворачивают стволы вниз до упора и отсоединяют от коробки;
  • если требуется почистить и смазать УСМ, поступают так: выкручивают шурупы и отделяют затылок от приклада, отворачивают удерживающий винт и извлекают втулку. Вывинчивают винт, который проходит сквозь приклад, а затем несильно ударяют коробкой о деревянную поверхность, чтобы ослабить соединение приклада и коробки. Затем снимают приклад.

Если предполагается хранить или перевозить ружье, то цевье присоединяется к снятым стволам.

Сборка МР-43 КН производится в обратном порядке. Полная разборка требуется только при повреждении или очень сильном загрязнении винтовки.

Для чистки и смазки потребуется оружейное масло, ветошь, ершик и шомпол.

Тюнинг

Большого поля деятельности для тюнинга нет. Возможна замена приклада на изделие из другой древесины или с более интересным орнаментом.

  • Можно установить быстросъемную антабку – на рукоять приклада.
  • Неплохой вариант – патронташ на несколько патронов в виде чехла на приклад.

Отзывы владельцев и цена на двуствольное курковое ружье МР-43KH (МР-43 КН) 510, 725 и др. описаны ниже.

Цена

Стоимость МР-43 КН вполне доступна, варьируется в пределах от 17450 р. до 21000 р. Длина ствола мало влияет на ценообразование.

Стоимость патронов в зависимости от баллистических характеристик колеблется от 15 до 58 р. за 1 шт.

Отзывы

Поклонники традиционного куркового ружья считают модель вполне удачной, несмотря на чрезмерную тонкость и легкость курка. Не менее привлекательна возможность установки разных дульных сужений.

Длина ствола оказалась второй самой привлекательной чертой. Модель с укороченным стволом – 510 мм, обогнала по популярности все остальные, так как незаменима для охоты на мелкую птицу.

В любом случае отмечается высокая кучность стрельбы, как на стандартных дистанциях, так и на более значительных – 50 м.

Ружье МР-43 КН 12/70 орех L-510

Аналоги

  • Предшественник МР-43 КН – ИЖ-43. По конструкции он близок к новой модели, но относится к бескурковым. Аналогом выступал ТОЗ-80, однако последний снят с производства.
  • Из зарубежных можно назвать Huglu Hammergun с 3-дюймовым патронником. Стоимость его, однако, заметно выше – около 1000$.

МР-43 КН – курковая гладкоствольная винтовка с возможностью смены дульного сужения. Это прекрасный вариант для охоты на мелкого зверя и птицу, тем более что Ижевский завод выпускает версии с разной длиной ствола.

Данное видео содержит отзыв на ружье МР-43КН:

Ижевские горизонталки сегодня — Охотники.ру

Накануне Отечественной войны 1812 года было произведено около 2 тысяч ружей. А в 1812 году уже более 6 тысяч кремневых ружей для армии. Первый заказ на производство охотничьих ружей поступил в 1875 году. Но уже в 1885-м на заводе изготавливалось 14 «разновидностей» одноствольных шомпольных ружей и 8 «разновидностей» двуствольных.

Беляк добытый из ИЖ-43. Фото: Моткова Владимира

Так что ассортимент был довольно большой и разнообразный. За прошедшие годы на заводе сложилась своя конструкторская школа, были воспитаны и подготовлены рабочие кадры, которые и ныне радуют охотников своей продукцией.

Первой ласточкой в классе горизонтальных двуствольных ружей было ИЖ-41.

О нем мало что известно в настоящее время. А жаль. Ружье очень достойное. Оно было выпущено в 1982 году. Все механизмы ружья оригинальны, просты по конструкции и имеют ряд преимуществ перед своими предшественниками. В ружье устанавлен универсальный ударно-спусковой механизм (УСМ) с двумя спусковыми крючками, каждый из которых работает на оба ствола.

Ружье оснащено эжекторным механизмом. Безопасность ружья обеспечивается двойным запиранием стволов, автоматическим предохранителем, запирающим шептала, а также перехватывателем (интерсептором) курков. На первых образцах УСМ был легкосъемным и фиксировался в ружье кнопкой. Курки и бойки монтировались раздельно (как в ИЖ-54). Боевые пружины пластинчатые, двуперные. Для производства плавного спуска курков достаточно при открытых стволах нажать на оба спусковых крючка, без предварительного перемещения предохранителя в переднее положение, и закрыть ружье.

Ружье ИЖ-41 выделывалось отдельными партиями и по заказам. А вот почему ружье не пошло в серию, знает только руководство завода. Конструкторы ИЖМЕХа, снимая с производства ранее выпускавшееся ружье, всегда убеждали охотников, что в процессе эксплуатации этого ружья был выявлен ряд недостатков, потребовавших «серьезных» конструктивных изменений». Но информация о выявленных «недостатках» умалчивалась.

Следующей горизонталкой было ружье ИЖ-43. Этой модели предшествовали такие ружья послевоенного производства, как ИЖ-49, ИЖ-54, ИЖ-26 и ИЖ-58. Но прежде чем вести разговор о ружье ИЖ-43, хотелось бы обратить внимание читателей на такое событие в оружейном производстве, которое прошло как-то мимо внимания охотников.

Вышеназванные модели горизонталок были весьма достойными ружьями. Они и сегодня не залеживаются в комиссионках.

ИЖ-43 – двуствольное ружье с горизонтальным соединением стволов. Оно явилось дальнейшей модернизацией ружья ИЖ-58 МА. Встает закономерный вопрос: а почему не ружья ИЖ-41? Ведь в него уже было много чего внедрено, что впоследствии в ИЖ-43 выдавалось, как «новье». Ну да ладно.

Ружья вырабатывались 12 и 16 калибров. Также было разработано ружье и 20 калибра, но в серию оно не пошло. Основные изменения коснулись УСМ и предохранителя. Также были удачно усовершенствованы эжекторы.

Одновременно с этим продолжались работы по совершенствованию ранее созданного универсального (УСМ) для двуствольного ружья ИЖ-41, каждый спусковой крючок которого позволял производить выстрелы повторным нажатием на него.

Универсальный (УСМ) также позволял вести стрельбу традиционным способом – путем поочередного нажатия на каждый спусковой крючок в соответствии с выбранной очередностью стрельбы. Все эти работы выполнялись под руководством талантливого инженера-конструктора А. Калинина, начальника бюро двуствольных ружей.

В 1986 году завод приступил к выпуску ружей ИЖ-43 и ИЖ-43 Е с универсальным УСМ. Но свалившаяся «перестройка», «новое» мышление и «сложившиеся производственные трудности» заставили руководство завода отказаться от своих намерений. Завод оставил за собой право выделывать ружья с универсальным УСМ отдельными партиями и по заказу.

ИЖ-43 и ИЖ-43Е продолжали выпускать, но с обычным УСМ. К идее универсального УСМ завод вернулся в новом тысячелетии и порадовал спортсменов и охотников его установкой на ряде моделей.

Модель ИЖ-43 отличают простота, надежность конструкции и высокая степень безопасности. В ИЖ-43 введена конструкция затвора с запиранием на два подствольных крюка рамкой Пердэ, курки выполнены с бойками как одно целое, но с отбоем. Таким образом, ИЖМЕХ окончательно ушел от системы тройного запирания. Предохранитель автоматический, запирает шептала и спусковые крючки. Ружье ИЖ-43 послужило базой для создания целого семейства модификаций.

ИЖ-43Е отличает от базовой модели эжекторный механизм селективного типа (выбрасывает только стреляную гильзу).

ИЖ-43-1С – ружье, УСМ которого оборудован одним спусковым крючком. Изменение последовательности очередности выстрелов осуществляется переключателем, расположенным на спусковом крючке.

ИЖ-43Е-1С – базовая модель с односпусковым механизмом (УСМ), обеспечивающим поочередные выстрелы из обоих стволов в любой последовательности. Ружье оборудовано эжектором селективного типа. Среди российских охотников имеется большая группа людей, благоговейно относящихся к горизонталкам, оборудованным курками на отдельных боковых досках. Они неустанно заглядывают в комиссионные магазины в надежде приобрести желанное ружье. Ижевские конструкторы пошли «навстречу пожеланиям» поклонников и ценителей курковых двустволок и наладили выпуск таких ружей.

ИЖ-43К – ружье с внутренними курками, но с ручным их взведением и нагнетанием боевых пружин с помощью наружных взводителей, которые расположены на фальшдосках, при беглом взгляде их можно принять за настоящие наружные курки обычной курковой двустволки. Надо помнить, что при открывании ружья курки не ВЗВОДЯТСЯ.

ИЖ-43КН – дальнейшая разработка базовой модели, которая представляет собой настоящую курковую двустволку. У ружей ИЖ-43К и ИЖ-43КН есть важная положительная черта: предохранитель обеспечивает безударный спуск курков с боевого взвода. Для этого необходимо кнопку предохранителя переместить в переднее положение. Затем, придерживая пальцем каждый взводитель (курок) отдельно и нажимая на соответствующий ему спусковой крючок, плавно и без удара перевести взводитель (курок) в переднее положение.

МР-213 – модификация ружья ИЖ-43. Сохранив все положительные характеристики своего прототипа, ружье получило новое качество: наличие быстросъемного универсального УСМ с одним или двумя спусковыми крючками и возможностью его отделения без специального инструмента, посредством нажатия на защелку, расположенную в задней части УСМ.

МР-213А – ружье с односпусковым отделяемым УСМ и кнопочным переключателем последовательности выстрелов, расположенным на спусковом крючке.

МР-213В – ружье с универсальным УСМ, представляющим собой два соединенных в блок односпусковых механизма, каждый с разной последовательностью выстрелов. Охотник имеет возможность заменить его односпусковым механизм такого же типа, как у МР-213А.

МР-213ЕС – модификация с эжектором и дополнительным УСМ. В этом ружье основной механизм – универсальный, дополнительно в комплекте прилагается односпусковой механизм с изменяемой очередностью выстрелов. Все модификации модели ИЖ-43 выделываются следующих калибров: 12/76, 12/70; 16/70; 20/76, 20/ 70; 28/70; 32/70 и 410 с патронником 76 мм.

Длина стволов в пределах: 12 калибра – 510, 675, 710, 725, 750 мм; 16-го – 710, 725 мм; 20/70 – 675, 710 и 760 мм, а 20/76 – 510, 675, 710 и 760 мм; 28-й и 32-й – 675, 710 и 760 мм; 410-й – 510, 675, 710 и 760 мм.

Ружья ИЖ-43 и их модификации выпускаются как с постоянными, так и сменными дульными устройствами. Масса ружей колеблется от 3,6 кг (12 калибр) и до 3,0 кг (32-й). Ружья с длиной патронников 76 мм допускают стрельбу патронами «магнум». В последние годы завод на базе модели МР-213 выпускает двуствольный штуцер МР-223 «Артемида» под патроны калибра 7,62х51 и более мощный 9,3х74R.

Следует признать как положительный фактор большой выбор гладкоствольных двуствольных ружей со стволами, расположенными в горизонтальной плоскости из семейства ИЖ-43 и его модификаций. Ружья отличает надежный бой на дистанциях 35–40 м. В случае отказа УСМ в ружьях МР-213 его замена не представляет сложности.

В качестве недостатков модели ИЖ-43 и ее модификаций можно отметить, что кнопка предохранителя слишком утоплена, и зимой в перчатке ее трудно передвигать. Бывают отказы в работе универсального УСМ. Низкое качество выделки ложа и цевья и их сопряжения с металлом. И конечно, неприглядный внешний вид.

Особенно это касается ружей ИЖ-43К и ИЖ-43КН. У наружных взводителей и курков довольно неприглядный внешний вид: словно их выгнули из проволоки, подвернувшейся случайно под руку, а винты на замочных досках как будто куплены в ближайшей железо-скобяной лавке. Про замочные доски я уж молчу – нарочно не придумаешь.

Складывается впечатление, что у дизайнеров не хватило вкуса сделать их классически красивыми. Что можно в целом сказать об этих ружьях? Если коротко, то замысел великолепный, а исполнение, к сожалению, никудышное. 20 июля 2006 года в день рождения ИЖМЕХа его генеральный директор В. Захваткин обещал «совершенствование технологии обработки деревянных деталей за счет приобретения и использования современных деревообрабатывающих станков с ЧПУ, улучшения внешнего вида оружия, снижения издержек в изготовлении, увеличение мощностей по производству сменных дульных насадок; мероприятий по энергосбережению».

Звучало обнадеживающе. А пока, что-то не видится успешного движения вперед. Вот и покупают российские охотники «забугорных красавиц», хотя по надежности и бою они не так уж и превосходят отечественных.

Виктор Гуров 14 мая 2015 в 08:00

отзывы, цена, технические характеристики, обзор

Аналоги

  • Предшественник МР-43 КН – ИЖ-43. По конструкции он близок к новой модели, но относится к бескурковым. Аналогом выступал ТОЗ-80, однако последний снят с производства.
  • Из зарубежных можно назвать Huglu Hammergun с 3-дюймовым патронником. Стоимость его, однако, заметно выше – около 1000$.

МР-43 КН – курковая гладкоствольная винтовка с возможностью смены дульного сужения. Это прекрасный вариант для охоты на мелкого зверя и птицу, тем более что Ижевский завод выпускает версии с разной длиной ствола.

Данное видео содержит отзыв на ружье МР-43КН:

Выборы [ править ]

Технические характеристики

Охотничье ружье ИЖ 43 обладает следующими ттх:

  • выпуск налажен в двух вариантах калибров – 12 и 16 мм;
  • длина патронника, мм – 70 и 76;
  • вес ружья – в пределах 3,6 кг;
  • длина стволов, мм – 660, 720 и 750;
  • настрел – от 15 000 выстрелов;
  • длина ружья в сборе, мм – не более 1 300.

Стволы ИЖ 43 съемного типа, с горизонтальным расположением, соединение их выполнено посредством прицельной и нижней планок. Казенная часть головки соединена муфтой и запрессована входящим штифтом.

Двойное закрытие стволов выполняется запорной планкой на два подствольных крюка. Ружья выпускаются с селективными эжекторами либо без них. Во втором варианте выбрасыватель не работает, извлечение гильз производят рукой.

Отъемное цевье крепится на стойке шарнира за счет использования защелки рычажного типа. И защелка, и шарнир крепятся в пазах цевья за счет винтов. Так как у ИЖ-43 на верхней плоскости цевья нет желоба, то площадь контакта выреза к стойке шарнира увеличивается.

Ударно-спусковой механизм ИЖ-43 куркового типа с внутренним расположением курков, которые имеют механизм отбоя и предохранительные взводы. И бойки, и пружины отбоя нераздельно соединены с курками. Винтовые боевые пружины и упор собраны в отдельный блок, который закреплен штифтом и является съемным. Сам спусковой механизм располагается на отдельной личинке. Он оснащен двумя спусковыми крючками, которые являются автономными. Снизу от крючков прикреплена спусковая скоба. Так как спусковые крючки являются подпружиненными к пяткам шептал, то люфта у них нет. На спусковых крючках имеются выступы, которые не позволяют совершить выстрел при не полностью закрытых стволах, что делает использование ИЖ-43 более безопасным.

Автоматический предохранитель запирает спусковые крючки и шептала. Для того, чтобы произвести безударный спуск курков на предохранительные взводы, нужно произвести следующие манипуляции:

  1. Полностью открыть стволы;
  2. Кнопку предохранителя нужно перевести в переднее положение;
  3. Двумя пальцами одновременно нажать на два спусковых крючка;
  4. Плавным движением закрыть ружье.

Сам предохранитель представляет собой деталь плоской формы, которая крепится на хвостовике ствольной коробки. Он подпружинен и укреплен на коробке за счет оси. Если сравнить кнопку предохранителя ИЖ-43 с кнопкой предохранителя ИЖ-58, то на 43 модели кнопка предохранителя имеет фиксацию шариком в верхнем положении.

Так как приклад ИЖ-58 был недостаточно эргономичен, в новой модели его решили немного модернизировать. Радиусный торец приклада ИЖ-58 был заменен новым контурным торцом, который имел прямой угол и внутренний радиус. Благодаря такому изменению формы приклада качка оружия во время стрельбы заметно уменьшилась.

Основные проблемы и их устранение

Принеся новое оружие домой, следует немедленно (до первой охоты) провести с ним ряд профилактических операций для предотвращения поломок при стрельбе. Так, деревянный приклад МР-153 может расколоться после первых же выстрелов. Поэтому следует снять его и узкой стамеской немного углубить в переднем торце паз, который в момент отката входит в хвостовик затворной рамы. Вылет его составляет около 6 мм, поэтому прорезать паз лучше с небольшим запасом – на глубину 8 мм. Заодно можно слегка срезать нависающее над ствольной коробкой дерево (в первую очередь в верхней его части). Также можно подогнать под себя геометрию пистолетной рукояти. Укоротить или удлинить приклад, обработав передний торец либо применив самостоятельно изготовленную прокладку. Обработанные места необходимо протереть ветошью, пропитанной льняным маслом. Если у приобретенного вами ружья МР-153 складной приклад, то описанные выше процедуры проводить не надо.

Также при желании еще до первых стрельб можно позаботиться о металле. Например, устранить заусенцы и острые кромки в ствольной коробке и других деталях, отшлифовать, отполировать раму, затвор, детали газоотвода. А также сделать радиальную выемку на передней части лотка для подачи патронов, с целью устранения «закусывания» пальца при набивании магазина. Проводя все эти операции, не следует забывать, что все работы нужно выполнять без фанатизма, придерживаясь принципа: «сто раз прикинь и один раз передумай».

Обслуживание

Чтобы оружие служило вам верой и правдой в течение нескольких десятков лет, за ним необходимо тщательно ухаживать. Для этого рекомендуется проводить регулярную чистку ружья от порохового нагара и смазку ружейным маслом. Такая процедура должна проводиться не позднее, чем через день после охоты или тренировочных выстрелов. В качестве инструментов подойдет обычный шомпол (идет в комплекте), чистая тряпочка и ружейное масло, которое можно приобрести в любом оружейном магазине.

Перед смазкой необходимо провести неполную разборку ружья, однако делать это нужно с особой тщательностью, поскольку даже малейшее повреждение детали может привести к нарушению работы всего механизма. Кроме того, необходимо тщательно смазывать все системы, которые могут быть подвержены пороховым газам, а не только дульный канал. Тогда вы сможете значительно повысить срок эксплуатации ружья.

Хранить МР-43 следует в сухом помещении, а вот температурный режим не столь важен. Располагать ружья необходимо в вертикальном положении, дабы масло не вытекало из дульного канала наружу. Конечно же, стоит предварительно разрядить оружие, прежде чем убрать его в сейф, а патроны хранить отдельно.

МР 43 КН 12/70 орех, длина ствола 510 мм

мр 43 (иж 43) — ружье для ценителей классической охоты. Гладкоствольные ружья с горизонтальным расположением стволов производятся на Ижевском механическом заводе.

Помните! Любое огнестрельное ору­жие представляет собой опасность для жизни и здоровья людей при легкомыслен­ном обращении с ним. Внимательно изу­чите и выполняйте указания по эксплуа­тации ружья.

Технические характеристики
Калибр, мм 12
Применяемый патрон 12х70
Длина ствола, мм 510
Емкость магазина, шт. 2
Масса, кг не более 3,4
приклад, цевье Орех
Инжекторный механизм нет
Дульные насадки нет (фиксированный чек целиндр)
Дополнительный ствол нет

Наименование

параметра

Значение параметра

Калибр

12

16

20

28

32

. 410

Длина (но­минальное значение), мм

патрон­ника

70

76,2

70

70

76,2

70

65

70

76,2

ствола

510

660

725

750

660

725

750

660

710

660

710

760

510

660

710

760

510

660

710

760

510

660

710

760

Диаметр канала ствола (номиналь­ное значение), мм

18,4

17,0

15,7

14

127

12,5

10,3

Среднее значение максимального дав­ления газов, при стрельбе эксплуатационными патрона­ми, измеренное кре- шерным/пьезоэлектрическим мето­дом, МПа, не более

65/74

90/105

68/78

72/83

90/105

72/83

90/105

Масса ружья, кг, не более

3,4

3,65

3,1

3,3

3,1

3,2

Ружье охотничье двуствольное МР 43 и его модификации предназначены для различных видов охоты, занятий спортом, для самообороны граждан и защиты их имущества.

Ружье охотничье двуствольное МР-43 выпуска­ется в следующих модификациях:

  • МР 43Е — модификация базовой модели с эжектором селективного типа (выбрасывающим только стреляную гильзу).
  • МР 43-1С — модель с односпусковым механизмом. Изменение последовательности выстрелов осуществляется переключателем, расположенном на спусковом крючке.
  • МР 43Е-1С — модификация базовой модели c односпусковым механизмом, обеспечивает поочередные выстрелы из обоих стволов в определенной последовательности. Эжектор селективного типа.
  • МР 43K — оригинальное исполнение базового ружья c ручным взведением ударного механизма наружными взводителями. Взводители в форме курков и декоративные замочные доски придают модели внешний вид классического куркового ружья. Отличается пониженным усилием открывания и повышенной безопасностью в эксплуатации.

Особенности:

  • Хороший баланс ружья обеспечивает удобное и быстрое прицеливание.
  • Классическая, наиболее распространенная в современном оружии конструкция затвора с запиранием на два подствольных крюка.
  • Для защиты от коррозии каналы и патронники хромируются.
  • Ружье производится как с постоянными дульными сужениями, так и со сменными дульными насадками, обеспечивающими стабильную кучность стрельбы. Номинальные значения (мм) дуль­ных сужений, предназначенных для стрельбы свин­цовой дробью, в зависимости от калибра ружья при­ведены в таблице:

Калибр

Обозначение дульных сужений

др

С

IC

М

F

Т

ХF

12

+0,4

0,0

0,25

0,5

0,75

1,0

1,25

16

0,0

0,25

0,5

0,75

1,0

20

0,0

0,25

0,5

0,75

1,0

28

0,0

0,15

0,25

0,40

0,6

0,8

32

0,0

0,15

0,25

0,38

0,5

0,7

. 410

0,0

0,12

0,25

0,38

0,5

0,7

  • Цевье и приклад ружья МР-43 изготавливается из  ореха, бука, березы
  • Предлагаемые варианты исполнения МР-43 позволяют выбрать ружье с различными потребительскими свойствами для различных целей.
  • Предохранитель — автоматический, запирающий одновременно и шептала, и спусковые крючки;
  • Кнопка предохранителя дополнительно фиксируется шариком. Устройство предохранителя обеспечивает возможность безударного спуска курков с боевого взвода (при патронах в патронниках этого делать не рекомендуется!). В варианте МР 43 и МР 43Е
  • Наружные взводители — фальшкурки — смонтированы на пластинах, крепящихся винтами на боковых поверхностях коробки ружья. В зависимости от модели — МР 43 КН
  • Весьма высокие баллистические показатели, простота устройства, надежность действия, неприхотливость эксплуатации.

Еще модификации:

МР-43-Е 12/70, 725мм, бук, фиксированный чок

МР-43-КН 12/70 орех, Д/Н,510мм, экспортный

МР-43 16/70 бук, Д/Н

МР-43-Е 12/70 «Стрела»

МР-43-Е-1С СТК «Стрела»

МР-43 12/70 бук,725мм, фиксированный чок

Предложение на сайте носит информационный характер и не является публичной офертой. Более подробную информацию о наличии, цене, характеристике и комплектации товара вы можете
узнать у менеджеров по телефону (3412) 23-03-23, или написав нам на электронный адрес[email protected]

МР 43 КН 12/70 орех, длина ствола 510 мм

мр 43 (иж 43) — ружье для ценителей классической охоты. Гладкоствольные ружья с горизонтальным расположением стволов производятся на Ижевском механическом заводе.

Помните! Любое огнестрельное ору­жие представляет собой опасность для жизни и здоровья людей при легкомыслен­ном обращении с ним. Внимательно изу­чите и выполняйте указания по эксплуа­тации ружья.

Технические характеристики
Калибр, мм 12
Применяемый патрон 12х70
Длина ствола, мм 510
Емкость магазина, шт. 2
Масса, кг не более 3,4
приклад, цевье Орех
Инжекторный механизм нет
Дульные насадки нет (фиксированный чек целиндр)
Дополнительный ствол нет

Наименование

параметра

Значение параметра

Калибр

12

16

20

28

32

.410

Длина (но­минальное значение), мм

патрон­ника

70

76,2

70

70

76,2

70

65

70

76,2

ствола

510

660

725

750

660

725

750

660

710

660

710

760

510

660

710

760

510

660

710

760

510

660

710

760

Диаметр канала ствола (номиналь­ное значение), мм

18,4

17,0

15,7

14

127

12,5

10,3

Среднее значение максимального дав­ления газов, при стрельбе эксплуатационными патрона­ми, измеренное кре- шерным/пьезоэлектрическим мето­дом, МПа, не более

65/74

90/105

68/78

72/83

90/105

72/83

90/105

Масса ружья, кг, не более

3,4

3,65

3,1

3,3

3,1

3,2

Ружье охотничье двуствольное МР 43 и его модификации предназначены для различных видов охоты, занятий спортом, для самообороны граждан и защиты их имущества.

Ружье охотничье двуствольное МР-43 выпуска­ется в следующих модификациях:

  • МР 43Е — модификация базовой модели с эжектором селективного типа (выбрасывающим только стреляную гильзу).
  • МР 43-1С — модель с односпусковым механизмом. Изменение последовательности выстрелов осуществляется переключателем, расположенном на спусковом крючке.
  • МР 43Е-1С — модификация базовой модели c односпусковым механизмом, обеспечивает поочередные выстрелы из обоих стволов в определенной последовательности. Эжектор селективного типа.
  • МР 43K — оригинальное исполнение базового ружья c ручным взведением ударного механизма наружными взводителями. Взводители в форме курков и декоративные замочные доски придают модели внешний вид классического куркового ружья. Отличается пониженным усилием открывания и повышенной безопасностью в эксплуатации.

Особенности:

  • Хороший баланс ружья обеспечивает удобное и быстрое прицеливание.
  • Классическая, наиболее распространенная в современном оружии конструкция затвора с запиранием на два подствольных крюка.
  • Для защиты от коррозии каналы и патронники хромируются.
  • Ружье производится как с постоянными дульными сужениями, так и со сменными дульными насадками, обеспечивающими стабильную кучность стрельбы. Номинальные значения (мм) дуль­ных сужений, предназначенных для стрельбы свин­цовой дробью, в зависимости от калибра ружья при­ведены в таблице:

Калибр

Обозначение дульных сужений

др

С

IC

М

F

Т

ХF

12

+0,4

0,0

0,25

0,5

0,75

1,0

1,25

16

0,0

0,25

0,5

0,75

1,0

20

0,0

0,25

0,5

0,75

1,0

28

0,0

0,15

0,25

0,40

0,6

0,8

32

0,0

0,15

0,25

0,38

0,5

0,7

.410

0,0

0,12

0,25

0,38

0,5

0,7

  • Цевье и приклад ружья МР-43 изготавливается из  ореха, бука, березы
  • Предлагаемые варианты исполнения МР-43 позволяют выбрать ружье с различными потребительскими свойствами для различных целей.
  • Предохранитель — автоматический, запирающий одновременно и шептала, и спусковые крючки;
  • Кнопка предохранителя дополнительно фиксируется шариком. Устройство предохранителя обеспечивает возможность безударного спуска курков с боевого взвода (при патронах в патронниках этого делать не рекомендуется!). В варианте МР 43 и МР 43Е
  • Наружные взводители — фальшкурки — смонтированы на пластинах, крепящихся винтами на боковых поверхностях коробки ружья. В зависимости от модели — МР 43 КН
  • Весьма высокие баллистические показатели, простота устройства, надежность действия, неприхотливость эксплуатации.

Еще модификации:

МР-43-Е 12/70, 725мм, бук, фиксированный чок

МР-43-КН 12/70 орех, Д/Н,510мм, экспортный

МР-43 16/70 бук, Д/Н

МР-43-Е 12/70 «Стрела»

МР-43-Е-1С СТК «Стрела»

МР-43 12/70 бук,725мм, фиксированный чок

Предложение на сайте носит информационный характер и не является публичной офертой. Более подробную информацию о наличии, цене, характеристике и комплектации товара вы можете
узнать у менеджеров по телефону (3412) 23-03-23, или написав нам на электронный адрес[email protected]

Модификации охотничьего ружья МР 43 (ИЖ 43)

Максимально используя составные части ружья ИЖ-43М, разработаны еще три модификации, обладающие по сравнению с базовой повышенными техническими и эксплуатационными характеристиками.

Модели ИЖ-43М и ИЖ-43ЕМ освоены заводом в 1986 г., а через два года запущены в производство ИЖ-43 и ИЖ-43Е.

Модель ИЖ-43ЕМ

Отличается от ИЖ-43М наличием механизма для автоматического выбрасывания стреляных гильз. Гильза выбрасывается из ствола, которым произведен выстрел. Введение эжекторного механизма потребовало изменения ствольной группы, шарнира, цевья и подавателя.

В сквозном отверстии муфты вместо одного размещаются два выбрасывателя.

Появились два дополнительных глухих отверстия на гребне муфты под винтовые пружины выбрасывателей и направляющие гнетки. Гнетки закреплены в головках выбрасывателей. На оси, в пазу шарнира, перьями пластинчатой пружины фиксируются в двух положениях левый и правый рычаги. Рычаги боковыми, верхними и задними выступами взаимодействуют в различные моменты с взводителями, выбрасывателями и подавателем.

Цевье имеет дополнительные пазы под рычаги и пружину рычагов, укрепленную к стеблю шарнира. Пружины выбрасывателей сжимаются при закрывании стволов.

Модель ИЖ-58МАЕ

Новый эжектор имеет ряд достоинств по сравнению с механизмом ружья ИЖ-58МАЕ: уменьшена качка головок выбрасывателей в направляющих и увеличен обхват закраины гильзы. Значительно большим стало выдвижение нестреляных патронов (с 2-3,5 мм до 8-9 мм) из патронников, что удобно для ручного извлечения.

Увеличена площадь контакта левого и правого рычагов с рабочими поверхностями выбрасывателя. Две автономные пружины выбрасывателей вместо одной общей, как в ИЖ-58МАЕ, повышают стабильность работы.

Ружья ИЖ-43 и ИЖ-43Е

Ружья ИЖ-43 и ИЖ-43Е — первые модели с двумя универсальными спусковыми крючками, выпускаемыми отечественной промышленностью серийно. Отличаются друг от друга вышеописанным эжекторным механизмом, о чем говорит буква «Е» в обозначении модели.

У ружья ИЖ-43 два универсальных спусковых крючка, каждый из которых работает на оба ствола; при этом передний спусковой крючок обеспечивает последовательность «правый — левый» ствол, а задний — «левый — правый». Кроме того, механизм позволяет вести стрельбу обычным способом, перебрасывая палец с одного спуска на другой при производстве второго выстрела. В магазинах встречаются очень редко!

Универсальный режим работы спускового механизма потребовал внести следующие изменения: на средней части спусковых крючков появились выступы, а на шепталах — выступы с пазами и боковые скосы. Дополнительно введены рычаг рамки, рамка, две пружины и две оси. У предохранителя вместо чеки двумя штифтами закреплен груз.

Механизм ИЖ-43 устраняет недостатки ружей как с двумя автономными спусковыми крючками, так и с одним универсальным, так как позволяет быстро выбрать последовательность стрельбы без отвлечения внимания от цели на переключение и в короткий промежуток времени произвести выстрелы из обоих стволов.

Ружья под индексом ИЖ-43-1С, ИЖ-43E-1C

С середины 90-х годов также производятся ружья под индексом ИЖ-43-1С, ИЖ-43E-1C с ударно-спусковым механизмом, имеющим один универсальный спусковой крючок, позволяющий производить поочередные выстрелы из обоих стволов в любой последовательности (аналогично ружьям ИЖ-27-1С,ИЖ-27Е-1С).

Разработана также модификация ружья, имеющая наружные взводители внутренних курков, маркируемая ИЖ-43К (К-курковая). Наружные взводители — фальшкурки — смонтированы на пластинах, крепящихся винтами на боковых поверхностях коробки ружья, поэтому его внешний вид несколько отличается от базовой модели.

Порядок разборки

6.1. Спустите курки 32, 42 с боевого взвода, снимите затылок приклада 73, выверните соединительный винт 71 и отделите приклад 70 от коробки 27. Поверните средник 51 на 90°. Выверните винт предохранительной скобы 65 и предохранительную скобу 64.

6.2. Выверните винты 61, 63, отделите от коробки средник 51 и личинку 62 с пружинами 77. Выколотите оси взводителей, курков и шептал 39, 43,30, извлеките из коробки взводители 38, шептала 31, 44, курки 32, 42 и штоки собранные 36, 37.

6.3. Механизм предохранителя 55, 46, 56 разбирается после удаления осей 45.

6.4. Для извлечения запорной планки 47 из коробки необходимо вытолкнуть ось 29, достать кулачок 28 и пружину 49 с упором 50, затем вывернуть винт 40 и через квадратное отверстие в рычаге запора 41 легкими ударами по рычагу запорной планки 52 вытолкнуть его вниз.

6.5. Для снятия спусковых крючков 66, 68 выколотите штифт 69 и извлеките пружины 67.

Дальнейшая разборка (в том числе и узла цевья) проста и не требует особых пояснений, т. к. сводится к выколачиванию и вывертыванию соответствующих осей и винтов.

Сборка ружья производится в порядке, обратном процессу разборки.

Читать киберфантастику онлайн на Призрачных мирах

Разборка

Для ухода за винтовкой периодически проводят процедуру неполной разборки. Порядок действий таков:

  • осматривают патронник на наличие патронов. Изымают их;
  • оттягивают защелку цевья на нижней его поверхности и поворачивают передний конец цевья от ствола. Отсоединяют цевье;
  • поворачивают рычаг запора в верхней части коробки вправо. Поворачивают стволы вниз до упора и отсоединяют от коробки;
  • если требуется почистить и смазать УСМ, поступают так: выкручивают шурупы и отделяют затылок от приклада, отворачивают удерживающий винт и извлекают втулку. Вывинчивают винт, который проходит сквозь приклад, а затем несильно ударяют коробкой о деревянную поверхность, чтобы ослабить соединение приклада и коробки. Затем снимают приклад.

Если предполагается хранить или перевозить ружье, то цевье присоединяется к снятым стволам.

Сборка МР-43 КН производится в обратном порядке. Полная разборка требуется только при повреждении или очень сильном загрязнении винтовки.

Для чистки и смазки потребуется оружейное масло, ветошь, ершик и шомпол.

Принцип работы

Конструкция ружья проста, очень неприхотлива, так что главным при обращении с двустволкой является не приложение чрезмерных усилий. При правильном выполнении инструкции усилия не нужны.

Зарядка карабина производится следующим образом:

  • поворачивают рычаг отпирания вправо до предела;
  • поворачивают стволы вниз до упора;
  • вкладывают последовательно патроны в патронник;
  • возвращают стволы в исходную позицию. При этом рычаг отпирания должен занять центральное положение, если ориентироваться на хвостовик. Если это не так, рычаг доводят рукой.

Особое внимание нужно уделять манипуляциям со сменными дульными сужениями. При этой процедуре нужно выполнить ряд требований:

  • все манипуляции разрешается проводить только на разряженной винтовке;
  • перед каждой стрельбой и после смены сужения проверять насколько хорошо затянуто сужение. Для затягивания используют специальный ключ из комплекта. При недостаточной затяжке пороховые газы прорываются в зазор между сужением и стволом, что приводит к деформации деталей и даже к вылету сужения;
  • сменное дульное сужение должно размещаться заподлицо относительно дульного среза или немного утопать;
  • дульное сужение ввинчивают до упора торца в выступ на канале ствола, но при этом между стволом и сужением остается зазор;
  • после установки канал осматривают: в месте соприкосновения торца сужения и выступа канала должно быть видно кольцо. Если нарушена целостность кольца, это означает деформацию сужения или посадочного места. Стрельба в этом случае запрещается.

Затяжку дульных сужений нужно проверять после 50–100 выстрелов.

Данное видео рассказывает об особенностях использования МР-43КН:

Тюнинг в домашних условиях

Одно из главных преимуществ ИЖ-43 перед конкурентами заключается в том, что оружие легко поддается модификации в домашних условиях. Обычно тюнинг подразделяется на три категории:

  1. Технический — модификации, вносящие изменения в ТТХ оружия или исправляющие недоработки производителя. К примеру, частой проблемой служит отказ эжектора от работы. Решить задачу можно с помощью напильника — нужно всего лишь слегка подровнять ствольный канал, в котором находятся гильзы. Ну а чтобы повысить мощность выстрела, можно провести обрезание ствола на 150 миллиметров (уменьшает кучность боя).
  2. Эксплуатационный — установка различного обвеса, который упрощает процесс использования оружия. К примеру, на прицельную планку «ласточкин хвост» охотники нередко устанавливают коллиматорный прицел или открытый целик с фиброоптической нитью. Также в эту же категорию относится крепление подствольного «обвеса» — ЛЦУ (лазерный целеуказатель), штык-нож или подствольный фонарь.
  3. Визуальный — апгрейд, который затрагивает только внешний вид оружия и не вносит каких-либо изменений в его работу. Чаще всего владельцы шлифуют деревянные детали наждачкой средней зернистости или покрывают ложе слоем лака. Ценители же могут попросить мастеров нанести на металл именные гравировки или даже сделать в оружии серебряные или золотые вставки.

МР-43 с коллиматорным прицеломИЖ-43 — это одно из самых удачных гладкоствольных ружей, выпущенных Ижевским механическим заводом. По своим характеристикам модель не уступает зарубежным аналогам, а высокая надежность и отличная система безопасности заставляют потенциального покупателя отдать предпочтение именно отечественному производителю.

Варианты и модификации

За почти 30 лет существования ружья ИЖ-43 вышло достаточно много интересных модификаций, вносящих некоторые изменение в конструкцию или внешний вид оружия. Вот лишь самые распространенные из них:

  1. ИЖ-43Е — эжекторная модель стандартного гладкоствольного ружья 12 калибра, которая выбрасывает использованный патрон при открывании ствола — крайне полезная система для тех, кто охотится на холоде.
  2. ИЖ-43-1С — вместо двух спусковых крючков в этой модели используется один «лепесток», а переключение между стволами осуществляется с помощью механизма, находящегося в верхней части ствольной коробки.
  3. ИЖ-43К — стандартное ружье 12 калибра с двумя фальшкурками. Оружие было разработано для экспорта в Штаты, однако российские охотники также заинтересовались им благодаря тому, что модель отличается быстрым съемом стволов.
  4. ИЖ-43КН — вариант ружья с полноценными наружными курками. Выпускается только в 12 калибре и используется для охоты на крупного зверя. От случайного выстрела оба «лепестка» защищены автоматическим предохранителем.

ИЖ-43КН с наружными курками

Вывод

Вы опытный стрелок, предпочитающий охотиться с комфортом и колоритом? Готовитесь к долгому переходу и подбираете соответствующее снаряжение? Смело берите «двадцатку», причем в целях экономии вполне подойдет ИЖ-58. Но если вы только решили постичь все прелести охоты на дичь и не хотите отбить желание, то лучше взять ружье 12-го или 16-го калибра. Даже подержанная модель в хорошем состоянии поможет смело отправляться в чащу или на болота.

Возникли сомнения относительно выбора ружья? Рекомендуется заручиться поддержкой знающего человека. Один из вариантов — спросить у продавца в магазине, какие российские/зарубежные модели «двадцатки» пользуются наибольшим спросом и что говорят о них владельцы. Это поможет сделать правильный выбор в пользу качественного ружья 20-го калибра.

Как сделать сигнальные потроны для охотничева ружья иж 43 12 калибра

Самодельные криминальные патроны.: papkin1 \u2014 LiveJournal

Бюджетное ружье \u2014 двустволка иж-43 — Милитари Блог

Сигнальный патрон Record. Испытание.

Бюджетное ружье \u2014 двустволка иж-43 — Милитари Блог

Продам ИЖ-43, 16 кал., 1990 г. — Guns.ru Talks

Бюджетное ружье \u2014 двустволка иж-43 — Милитари Блог

МР-43 \u2014 АО «ИЖЕВСКИЙ МЕХАНИЧЕСКИЙ ЗАВОД»

Ружье Baikal МР 43 КН орех д/н 12×70 510мм

Вкладной ствол ТК600 : продукция ЗАО Техкрим

Бюджетное ружье \u2014 двустволка иж-43 — Милитари Блог

Крепление универсальное НА 10 СЛОТОВ (кронштейн, база ВИВЕРА …

Устройство охотничьего ружья: основные части и их назначение …

Запчасти МР-43 (ИЖ-43)

Ружье ИЖ-43Е-1С 12/76, 710мм, орех

Запчасти МР-43 (ИЖ-43)

Устройство охотничьего ружья: основные части и их назначение …

ИЖ 27Е: характеристики ружья, калибр, описание и отзывы …

Выбор бюджетного ружья для туризма. : Самооборона в России

Ружье МР (ИЖ) 43 М орех д/н 20к купить в интернет-магазине …

Продам ИЖ-43, 16 кал., 1990 г. — Guns.ru Talks

Бюджетное ружье \u2014 двустволка иж-43 — Милитари Блог

Запчасти МР-43 (ИЖ-43)

ИЖ 27Е: характеристики ружья, калибр, описание и отзывы …

Однозарядные одноствольные охотничьи ружья с откидывающимися …

ИЖ 27Е: характеристики ружья, калибр, описание и отзывы …

ОРУЖЕЙКА: Патроны к травматическим пистолетам

Запчасти МР-133 купить в ИжОхота

Травматическое оружие самообороны — Охотники.ру

Одноствольные ружья ИЖ-КБ, ИЖ-18, нарезное ружьё ИЖ-18Н.

МР-43 \u2014 АО «ИЖЕВСКИЙ МЕХАНИЧЕСКИЙ ЗАВОД»

Многозарядные гладкоствольные охотничьи ружья …

Сигнальный патрон для ракетниц 4 калибр, 26мм купить —

Новогодний патрон 12 калибра,салют из ружья

Где купить охотничьи патроны в СПБ — патроны для самообороны …

Запчасти для охотничьего и пневматического оружия …

Устройство охотничьего ружья: основные части и их назначение …

Шумовые,газовые,холостые патроны 8 мм купить без лицензии в …

Пистолет Макарова \u2014 Википедия

Специальный револьвер ТОЗ-81 «Марс» » Военное обозрение

Оружейный магазин STVOL, товары для охоты, спорта и туризма …

Многозарядные гладкоствольные охотничьи ружья …

Ружье МР-43 12/70,725мм,орех

Как зарядить пулю 20 калибра

Ружье МР 43 12/76 Бук, L-750 мм., цена 18400, купить null …

Обрез БРАТ 2 охолощенный под СХП, купить в Москве с …

12 калибр \u2014 Wikihunt

ОПАСНО! НЕ ПОВТОРЯТЬ! Как стреляют 50-летние патроны | Я в ШОКЕ! Патроны 1969 года

МР-43КН как оружие самообороны и для охоты / Стрелковое …

8 калибр \u2013 Калибр огнестрельного оружия \u2014 Определитель …

ИталРужьё — Новости

Самозарядное охотничье ружьё модель ST 155, к.12х76, L\u003d760 …

Многозарядные гладкоствольные охотничьи ружья …

Приклад и цевье ИЖ-27 (МР-27) 12 калибр (пластмасса, с …

Охотничье ружье ИЖ 27 (МР 27): подробный обзор и технические …

Сокрушительный двенадцатый калибр. Гладкоствольное

Шумовые,газовые,холостые патроны 8 мм купить без лицензии в …

Выбор травматического оружия (Часть I. Патроны)

Калибр \u2014 Википедия

Ружье МР-43Е 12/70 Бук.: продажа, цена в Ижевске. гладкоствольные охотничьи ружья от \

Ружье МР-43 12/70,725мм,орех

Сначала изучи, потом стреляй! — Охотники.ру

Сокрушительный двенадцатый калибр. Гладкоствольное

Многозарядные гладкоствольные охотничьи ружья …

Запчасти для охотничьего и пневматического оружия …

Популярное гладкоствольное ружьё иж-12 — Милитари Блог

Травматический патрон 12 калибра, Ружье HATSAN MPS

Однозарядные одноствольные охотничьи ружья с откидывающимися …

Выбор ружья для путешествия на лодке — Оборудование …

Отечественные ружья \u2013 10 лучших охотничьих ружей \u2014 Рейтинг …

Оружейный магазин STVOL, товары для охоты, спорта и туризма …

За рулем \u2013 со стволом: как правильно и безопасно возить с …

Пистолет ПМ ТТХ. Фото. Видео. Устройство. Вес

Ружье Иж 5 Отзывы — museletter

ИталРужьё — Новости

Приклад+цевье МР 43 Монте Карло орех

Насадка дульная удлиняющая (насадок, удлинитель ствола …

Запчасти МР-43 (ИЖ-43)

МР-43КН как оружие самообороны и для охоты / Стрелковое …

Полицейские карабины семейства КС-23. Часть первая » Военное …

Сигнальный автомат АК (АК 47 Калашников) купить в Москве …

Гладкоствольный 9, 6/53 Lancaster : продукция ЗАО Техкрим

иж — все объявления о продаже

8 калибр \u2013 Калибр огнестрельного оружия \u2014 Определитель …

Где купить охотничьи патроны в СПБ — патроны для самообороны …

Все про патроны для гладкоствольного оружия

Устройство охотничьего ружья: основные части и их назначение …

СНАРЯЖЕНИЕ ОХОТНИКА. Огнестрельное охотничье ружье …

Бюджетное ружье \u2014 двустволка иж-43 — Милитари Блог

Обрез ружья 12 калибра

Охотничье ружье иж-43: отзывы, фото с описанием и технические характеристики

МР 43 КН 12/70 орех, длина ствола 510 мм

мр 43 (иж 43) — ружье для ценителей классической охоты. Гладкоствольные ружья с горизонтальным расположением стволов производятся на Ижевском механическом заводе.

Помните! Любое огнестрельное ору­жие представляет собой опасность для жизни и здоровья людей при легкомыслен­ном обращении с ним. Внимательно изу­чите и выполняйте указания по эксплуа­тации ружья.

Технические характеристики
Калибр, мм 12
Применяемый патрон 12х70
Длина ствола, мм 510
Емкость магазина, шт. 2
Масса, кг не более 3,4
приклад, цевье Орех
Инжекторный механизм нет
Дульные насадки нет (фиксированный чек целиндр)
Дополнительный ствол нет

Наименование

параметра

Значение параметра

Калибр

12

16

20

28

32

.410

Длина (но­минальное значение), мм

патрон­ника

70

76,2

70

70

76,2

70

65

70

76,2

ствола

510

660

725

750

660

725

750

660

710

660

710

760

510

660

710

760

510

660

710

760

510

660

710

760

Диаметр канала ствола (номиналь­ное значение), мм

18,4

17,0

15,7

14

127

12,5

10,3

Среднее значение максимального дав­ления газов, при стрельбе эксплуатационными патрона­ми, измеренное кре- шерным/пьезоэлектрическим мето­дом, МПа, не более

65/74

90/105

68/78

72/83

90/105

72/83

90/105

Масса ружья, кг, не более

3,4

3,65

3,1

3,3

3,1

3,2

Ружье охотничье двуствольное МР 43 и его модификации предназначены для различных видов охоты, занятий спортом, для самообороны граждан и защиты их имущества.

Ружье охотничье двуствольное МР-43 выпуска­ется в следующих модификациях:

  • МР 43Е — модификация базовой модели с эжектором селективного типа (выбрасывающим только стреляную гильзу).
  • МР 43-1С — модель с односпусковым механизмом. Изменение последовательности выстрелов осуществляется переключателем, расположенном на спусковом крючке.
  • МР 43Е-1С — модификация базовой модели c односпусковым механизмом, обеспечивает поочередные выстрелы из обоих стволов в определенной последовательности. Эжектор селективного типа.
  • МР 43K — оригинальное исполнение базового ружья c ручным взведением ударного механизма наружными взводителями. Взводители в форме курков и декоративные замочные доски придают модели внешний вид классического куркового ружья. Отличается пониженным усилием открывания и повышенной безопасностью в эксплуатации.

Особенности:

  • Хороший баланс ружья обеспечивает удобное и быстрое прицеливание.
  • Классическая, наиболее распространенная в современном оружии конструкция затвора с запиранием на два подствольных крюка.
  • Для защиты от коррозии каналы и патронники хромируются.
  • Ружье производится как с постоянными дульными сужениями, так и со сменными дульными насадками, обеспечивающими стабильную кучность стрельбы. Номинальные значения (мм) дуль­ных сужений, предназначенных для стрельбы свин­цовой дробью, в зависимости от калибра ружья при­ведены в таблице:

Калибр

Обозначение дульных сужений

др

С

IC

М

F

Т

ХF

12

+0,4

0,0

0,25

0,5

0,75

1,0

1,25

16

0,0

0,25

0,5

0,75

1,0

20

0,0

0,25

0,5

0,75

1,0

28

0,0

0,15

0,25

0,40

0,6

0,8

32

0,0

0,15

0,25

0,38

0,5

0,7

.410

0,0

0,12

0,25

0,38

0,5

0,7

  • Цевье и приклад ружья МР-43 изготавливается из  ореха, бука, березы
  • Предлагаемые варианты исполнения МР-43 позволяют выбрать ружье с различными потребительскими свойствами для различных целей.
  • Предохранитель — автоматический, запирающий одновременно и шептала, и спусковые крючки;
  • Кнопка предохранителя дополнительно фиксируется шариком. Устройство предохранителя обеспечивает возможность безударного спуска курков с боевого взвода (при патронах в патронниках этого делать не рекомендуется!). В варианте МР 43 и МР 43Е
  • Наружные взводители — фальшкурки — смонтированы на пластинах, крепящихся винтами на боковых поверхностях коробки ружья. В зависимости от модели — МР 43 КН
  • Весьма высокие баллистические показатели, простота устройства, надежность действия, неприхотливость эксплуатации.

Еще модификации:

МР-43-Е 12/70, 725мм, бук, фиксированный чок

МР-43-КН 12/70 орех, Д/Н,510мм, экспортный

МР-43 16/70 бук, Д/Н

МР-43-Е 12/70 «Стрела»

МР-43-Е-1С СТК «Стрела»

МР-43 12/70 бук,725мм, фиксированный чок

Предложение на сайте носит информационный характер и не является публичной офертой. Более подробную информацию о наличии, цене, характеристике и комплектации товара вы можете
узнать у менеджеров по телефону (3412) 23-03-23, или написав нам на электронный адрес[email protected]

Характеристики охотничьего ружья ИЖ 43

Основные характеристики охотничьего ружья ИЖ 43:

  • Калибр: 12, 16;
  • Длинна патронника: 70, 76;
  • Длинна ствола:  660, 720, 750;
  • Диаметр канала ствола: 18,4;
  • Масса ружья: 3,6 кг.

Стволы

Съемные стволы расположены в горизонтальной плоскости, соединены между собой при помощи нижней и прицельной планок, в казенной части — муфтой, куда обе ствольные трубки предварительно запрессовывают и стопорят штифтом. Прицельная планка сверху гильотирована, спереди ввинчена мушка. К нижней планке двумя винтами прикреплена антабка для ремня. Между стволами припаяна стойка шарнира с зубом под защелку цевья.

В сквозном отверстии муфты стволов размещается выбрасыватель, состоящий из цилиндрического направляющего стержня с приваренной сзади головкой. В верхнюю часть головки запрессован  штифт, входящий в глухое отверстие муфты. От выпадания из стволов выбрасыватель удерживается ограничительным винтом.

Удаление гильз

Выдвижение стреляных гильз из патронника осуществляется общим выталкивателем, путем воздействия на его передний конец подавателя при открывании ружья. Окончательное удаление гильз производят рукой.

В отличие от ранее выпускавшейся модели ИЖ-58МА на муфте убран верхний малый крюк, основное назначение которого — устранение поворота и обеспечение лишь поступательного перемещения выбрасывателя.
Отсутствие малого крюка увеличило площадь прилегания казенного среза стволов к щитку коробки. Повысилось удобство заряжания и извлечения патронов. Живучесть ружья не менее 15 тыс. выстрелов.

Цевье

Цевье отъемное, закрепляется на стойке шарнира защелкой рычажного типа. Защелка и шарнир укреплены тремя винтами в соответствующих пазах цевья.

По сравнению с ИЖ-58МА на верхней плоскости стебля шарнира нет желоба, увеличилась площадь контакта переднего прямоугольного выреза к стойке шарнира.

Запирание стволов

Запирание стволов — двойное, надвижением запорной планки на два нижних подствольных крюка. Рычаг запора винтом укреплен на квадратной головке рычага запорной планки. На нее действует пружина запорной планки через кулачок. Поворотом рычага запора вправо производят отпирание ружья.

Ударный механизм

Ударный механизм — курковый, с внутренним расположением. Курки имеют отбой и предохранительные взводы. Бойки и пружины отбоя исполнены в неразъемном соединении с курками.  Отдельным съемным блоком собраны на штоках винтовые боевые пружины и упор, закрепленный штифтом. Сжатие боевых пружин и постановка курков на боевые взводы происходят при открывании стволов.

Спусковой механизм

Спусковой механизм смонтирован на отдельной личинке с двумя автономными спусковыми крючками, имеющими отверстие под ось и окна под пружины. Снизу привернута предохранительная скоба. Подпружинивание спусковых крючков к пяткам шептал устраняет люфт.

Передний спусковой крючок подпружинен еще и для того, чтобы предохранить указательный палец от удара во время выстрела из левого ствола, то есть при нажатии на задний спусковой крючок. Передние верхние выступы на спусковых крючках не позволяют произвести выстрел при не полностью закрытых стволах, повышая тем самым степень безопасности эксплуатации ружья.

Предохранитель

Предохранитель автоматический, запирает шептала и спусковые крючки. Возможен безударный (плавный) спуск курков с боевых взводов на предохранительные, для чего необходимо при полностью открытых стволах переместить кнопку предохранителя в переднее положение, нажать указательным и средним пальцем на оба спусковых крючка и плавно закрыть ружье.

Сам предохранитель — плоская деталь, укрепленная на хвостовике коробки осью и подпружиненная по часовой стрелке. Ось кнопки ходит в фигурном пазу предохранителя. Снизу в отверстиях закреплена чека.

По сравнению с предшествующими моделями кнопка предохранителя дополнительно фиксируется шариком в переднем положении.

Приклад

Приклад крепится к среднику, расположенному между хвостовиком коробки и личинкой, а передним торцом поджат стяжным винтом к кососрезанным поверхностям коробки. Отверстие под стяжной винт в заднем торце приклада закрывается затыльником, укрепленным двумя шурупами.

Передний радиусный торец приклада ИЖ-58МА заменен торцом на контур, с прямым углом и внутренним радиусом. Такой контур уменьшает качку приклада во время эксплуатации.

Обзор последних моделей Осы

Рассмотрим отличие последних моделей травмата Оса, технические характеристики которых отличаются от более ранних вариантов по мощи и поражению.

  • больший размер калибра по сравнению с предшественниками;
  • увеличившаяся действенная мощь пистолета;
  • патроны от старых моделей не могут использоваться в последней модели пистолета;
  • навески пороха стали больше, что позволило пуле иметь более улучшенные характеристики по баллистике.

Двуствольная Оса ПБ-2 «Эгида»

Варианты и модификации

  • ПБ-2 «Эгида» — модификация с 2 патронами под размер 18×45 мм. Производится с 2006 года;
  • ПБ-4 «ОСА» — модификация на 4 патрона 18×45 мм. Изготавливается с 1999 года выпуск начат в 1999 году. Сейчас не выпускается;
  • ПБ-4В (индекс ГРАУ-6П56) — это военная модификация пистолета. Состоит на вооружении с 2002 года;
  • ПБ-4-1МЛ — вариант на 4 заряда ориентированный под размер патрона — 18×45 мм. В наличии лазерный целеуказатель. Изготавливается с июля 2003 года;
  • ПБ-4-2 — пистолет, изготовленный на 4 заряда. Патрон — 18,5×55 мм, немного большим по длине стволом и улучшенным прицелом;
  • OSA Flare Gun — модель имеет пластмассовый корпус, который окрашен в оранжевый цвет. Оснащена 4 патронами;
  • ПБ-4-3 «Компакт» — модификация, изготовленная для патронов 15×40 мм;
  • М-9 — вариант четырех зарядного пистолета под патрон 18,5×55 мм. Отличается от других моделей — это датчик, включающий ЛЦУ автоматически, при обхвате рукоятки рукой.

Новый травматический пистолет «Оса Компакт» относится к категории «оружие для самообороны». В соответствии с принятыми законодательными актами в Российской Федерации — травматика Оса является огнестрельным оружием ограниченного поражения.

Огнестрельное оружие «Оса Компакт» имеет некоторые характерные отличия от пистолета Оса ПБ-4-1МЛ:

  • в «Оса Компакт» применяется патрон 15×40, имеющий меньшую толщину стенки гильзы и более короткую гильзу по сравнению с пистолетом «Оса ПБ-4». Такие новшества сократили толщину пистолета;
  • пистолет «Оса Компакт» оснащена двусторонним флажковым предохранителем, при выключении которого включается ЛЦУ;
  • «Оса Компакт» оснащен лазерным целеуказателем для кратковременно ослепления противника;
  • в отличие от других версий, «Оса Компакт» не оснащен спусковой скобой. С одной стороны, это уменьшение размера пистолета, но с другой стороны, необходимо носить только с включенным предохранителем.

Технические характеристики Оса Компакт:

Калибр:  15×40
Длина:  117.5 мм
Высота:  106 мм
 Ширина:  32 мм
Масса без патронов:  350 г.
Емкость блока: 4 патрона
Усилие спуска: 0,9-1,04 кгс
Источник питания на выстрел и ЛЦУ:  БАТАРЕЯ CR-123

Вид сбоку

Технические характеристики двуствольной Осы ПБ-2 Эгида:

Применяемые патроны 18x45T (с резиновой пулей)
18х45СЗ (светозвуковой)
18х45С (сигнальный)
18х45O (осветительный)
Диаметр резиновой пули 15,3 мм
Количество патронов 2 шт
Масса с патронами 240 гр
Масса без патронов 190 гр
Длина 113 мм
Ширина 27 мм
Высота 104 мм
Начальная скорость полета резиновой пули 120 м/сек
Эффективная дальность стрельбы 10 метров
Усилие спуска 3,5-4,5 кгс
Источник питания
для стрельбы импульсный генератор МИГ-1К1
для ЛЦУ Литийионный аккумулятор
Температурный диапазон применения:
стрельба от -30° до +50° C,
ЛЦУ – от -10° до +40° C;
Кучность стрельбы на дальности 10 метров: для серии из 10 выстрелов не более 300 мм

История создания

Авто с двигателем 645 ЗИЛ проектировалось и создавалось на заводе имени Лихачева в семидесятые годы прошлого столетия. На то время в стране наблюдался дефицит производительной техники с высокими эксплуатационными параметрами, что во многом повлияло на компоновку и возможности новой машины.

Конструкторами комбината совместно с камскими инженерами была разработана принципиально новая модификация. В ее основу заложена одна из моделей КамАЗа. Грузовик получил улучшенное освещение, продуктивный силовой агрегат и современный экстерьер. В результате получился автомобиль, который по праву можно причислить к лучшим образцам техники, выпущенной в Советском Союзе.

Первый экземпляр был презентован в 1977 году. Модернизация машины продолжалась до 1985 года. Дизель ЗИЛ-645 в серийное производство стал с 1987 г. Авто оснастили агрегатом на 165 конских сил (работающим на солярке или комбинированной топливной смеси), пятиступенчатой коробкой переключения скоростей механического типа. Следующая версия выходила уже с трансмиссией на девять синхронизированных диапазонов.

Выборы [ править ]

МР 43 КН 12/70 орех, длина ствола 510 мм

мр 43 (иж 43) — ружье для ценителей классической охоты. Гладкоствольные ружья с горизонтальным расположением стволов производятся на Ижевском механическом заводе.

Помните! Любое огнестрельное ору­жие представляет собой опасность для жизни и здоровья людей при легкомыслен­ном обращении с ним. Внимательно изу­чите и выполняйте указания по эксплуа­тации ружья.

Технические характеристики
Калибр, мм 12
Применяемый патрон 12х70
Длина ствола, мм 510
Емкость магазина, шт. 2
Масса, кг не более 3,4
приклад, цевье Орех
Инжекторный механизм нет
Дульные насадки нет (фиксированный чек целиндр)
Дополнительный ствол нет

Наименование

параметра

Значение параметра

Калибр

12

16

20

28

32

.410

Длина (но­минальное значение), мм

патрон­ника

70

76,2

70

70

76,2

70

65

70

76,2

ствола

510

660

725

750

660

725

750

660

710

660

710

760

510

660

710

760

510

660

710

760

510

660

710

760

Диаметр канала ствола (номиналь­ное значение), мм

18,4

17,0

15,7

14

127

12,5

10,3

Среднее значение максимального дав­ления газов, при стрельбе эксплуатационными патрона­ми, измеренное кре- шерным/пьезоэлектрическим мето­дом, МПа, не более

65/74

90/105

68/78

72/83

90/105

72/83

90/105

Масса ружья, кг, не более

3,4

3,65

3,1

3,3

3,1

3,2

Ружье охотничье двуствольное МР 43 и его модификации предназначены для различных видов охоты, занятий спортом, для самообороны граждан и защиты их имущества.

Ружье охотничье двуствольное МР-43 выпуска­ется в следующих модификациях:

  • МР 43Е — модификация базовой модели с эжектором селективного типа (выбрасывающим только стреляную гильзу).
  • МР 43-1С — модель с односпусковым механизмом. Изменение последовательности выстрелов осуществляется переключателем, расположенном на спусковом крючке.
  • МР 43Е-1С — модификация базовой модели c односпусковым механизмом, обеспечивает поочередные выстрелы из обоих стволов в определенной последовательности. Эжектор селективного типа.
  • МР 43K — оригинальное исполнение базового ружья c ручным взведением ударного механизма наружными взводителями. Взводители в форме курков и декоративные замочные доски придают модели внешний вид классического куркового ружья. Отличается пониженным усилием открывания и повышенной безопасностью в эксплуатации.

Особенности:

  • Хороший баланс ружья обеспечивает удобное и быстрое прицеливание.
  • Классическая, наиболее распространенная в современном оружии конструкция затвора с запиранием на два подствольных крюка.
  • Для защиты от коррозии каналы и патронники хромируются.
  • Ружье производится как с постоянными дульными сужениями, так и со сменными дульными насадками, обеспечивающими стабильную кучность стрельбы. Номинальные значения (мм) дуль­ных сужений, предназначенных для стрельбы свин­цовой дробью, в зависимости от калибра ружья при­ведены в таблице:

Калибр

Обозначение дульных сужений

др

С

IC

М

F

Т

ХF

12

+0,4

0,0

0,25

0,5

0,75

1,0

1,25

16

0,0

0,25

0,5

0,75

1,0

20

0,0

0,25

0,5

0,75

1,0

28

0,0

0,15

0,25

0,40

0,6

0,8

32

0,0

0,15

0,25

0,38

0,5

0,7

.410

0,0

0,12

0,25

0,38

0,5

0,7

  • Цевье и приклад ружья МР-43 изготавливается из  ореха, бука, березы
  • Предлагаемые варианты исполнения МР-43 позволяют выбрать ружье с различными потребительскими свойствами для различных целей.
  • Предохранитель — автоматический, запирающий одновременно и шептала, и спусковые крючки;
  • Кнопка предохранителя дополнительно фиксируется шариком. Устройство предохранителя обеспечивает возможность безударного спуска курков с боевого взвода (при патронах в патронниках этого делать не рекомендуется!). В варианте МР 43 и МР 43Е
  • Наружные взводители — фальшкурки — смонтированы на пластинах, крепящихся винтами на боковых поверхностях коробки ружья. В зависимости от модели — МР 43 КН
  • Весьма высокие баллистические показатели, простота устройства, надежность действия, неприхотливость эксплуатации.

Еще модификации:

МР-43-Е 12/70, 725мм, бук, фиксированный чок

МР-43-КН 12/70 орех, Д/Н,510мм, экспортный

МР-43 16/70 бук, Д/Н

МР-43-Е 12/70 «Стрела»

МР-43-Е-1С СТК «Стрела»

МР-43 12/70 бук,725мм, фиксированный чок

Предложение на сайте носит информационный характер и не является публичной офертой. Более подробную информацию о наличии, цене, характеристике и комплектации товара вы можете
узнать у менеджеров по телефону (3412) 23-03-23, или написав нам на электронный адрес[email protected]

Основные проблемы и их устранение

Принеся новое оружие домой, следует немедленно (до первой охоты) провести с ним ряд профилактических операций для предотвращения поломок при стрельбе. Так, деревянный приклад МР-153 может расколоться после первых же выстрелов. Поэтому следует снять его и узкой стамеской немного углубить в переднем торце паз, который в момент отката входит в хвостовик затворной рамы. Вылет его составляет около 6 мм, поэтому прорезать паз лучше с небольшим запасом – на глубину 8 мм. Заодно можно слегка срезать нависающее над ствольной коробкой дерево (в первую очередь в верхней его части). Также можно подогнать под себя геометрию пистолетной рукояти. Укоротить или удлинить приклад, обработав передний торец либо применив самостоятельно изготовленную прокладку. Обработанные места необходимо протереть ветошью, пропитанной льняным маслом. Если у приобретенного вами ружья МР-153 складной приклад, то описанные выше процедуры проводить не надо.

Также при желании еще до первых стрельб можно позаботиться о металле. Например, устранить заусенцы и острые кромки в ствольной коробке и других деталях, отшлифовать, отполировать раму, затвор, детали газоотвода. А также сделать радиальную выемку на передней части лотка для подачи патронов, с целью устранения «закусывания» пальца при набивании магазина. Проводя все эти операции, не следует забывать, что все работы нужно выполнять без фанатизма, придерживаясь принципа: «сто раз прикинь и один раз передумай».

Варианты и модификации

За почти 30 лет существования ружья ИЖ-43 вышло достаточно много интересных модификаций, вносящих некоторые изменение в конструкцию или внешний вид оружия. Вот лишь самые распространенные из них:

  1. ИЖ-43Е — эжекторная модель стандартного гладкоствольного ружья 12 калибра, которая выбрасывает использованный патрон при открывании ствола — крайне полезная система для тех, кто охотится на холоде.
  2. ИЖ-43-1С — вместо двух спусковых крючков в этой модели используется один «лепесток», а переключение между стволами осуществляется с помощью механизма, находящегося в верхней части ствольной коробки.
  3. ИЖ-43К — стандартное ружье 12 калибра с двумя фальшкурками. Оружие было разработано для экспорта в Штаты, однако российские охотники также заинтересовались им благодаря тому, что модель отличается быстрым съемом стволов.
  4. ИЖ-43КН — вариант ружья с полноценными наружными курками. Выпускается только в 12 калибре и используется для охоты на крупного зверя. От случайного выстрела оба «лепестка» защищены автоматическим предохранителем.

ИЖ-43КН с наружными курками

Недостатки

Согласно отзывам, ИЖ-43 обладает достаточно небольшим списком недостатков, которые практически никак не влияют на эксплуатационные качества оружия. Большинство недовольств вызваны слишком широкой прицельной планкой, которая не позволяет быстро и точно прицелиться охотнику с большой дистанции, поскольку мушка практически полностью закрывает силуэт даже крупного животного. Однако этот недостаток с легкостью может быть исправлен, если установить на ружье коллиматорный прицел.

Также стоит отметить, что первые образцы оружия выпускались с большим количеством брака. Особенно актуально это звучит для ружья ИЖ-43 12 калибра. Однако подобная тенденция была со временем исправлена и теперь приобрести бракованный образец можно только у кого-нибудь с рук. Ну а если вам все-таки не повезет с приобретением МР-43 в магазине, то вы всегда можете вернуть товар обратно для замены. Нужно лишь сохранить чек и коробку.

Что есть сегодня?

Ружья ижевского производства получили внешние курки. Реализация такой конструкции началась с модели с индексом «К». Внешними там стали взводители. Курки и бойки остались неизменными от стандартной версии. Модификация «КН» получила полноценные внешние курки и бойки в брандтрубках. В связи с этим конструкторам пришлось увеличить прочность боевых пружин.

Английские стрелки к внешнекурковому орудию испытали симпатию, поэтому появился спрос. Двустволку использовали на соревнованиях по ковбойской стрельбе. В связи с этим безопасность эксплуатации ружья была повышена. В устройство добавлен автоматический предохранитель и блокировка бойка, исключающая любую возможность случайного выстрела.

Состав изделия и комплектность

4.1. Перечень сборочных единиц и деталей ружья указан в таблице 2.

Таблица 2.

Обозн-е на рисунке Наименование Кол-во Обозн-е на рисунке Наименование Кол-во
1 Стволы собранные 1 42 Курок собранный правый 1
2 Пружина выбрасывателя 2 43 Ось курков 1
3 Гнеток 2 44 Шептало правое 1
4 Выбрасыватель правый 1 45 Ось предохранителя и кнопки 3
5 Выбрасыватель левый 1 46 Кнопка 1
6 Винт 1 47 Планка запорная 1
7 Ось антабки 2 48 Тяга 1
8 Кольцо антабки 2 49 Пружина планки запорной 1
9 Винт 2 50 Упор кулочка 1
10 Основание антабки ствольной 1 51 Средник 1
11 Мушка 1 52 Рычаг планки запорной 1
12 Цевьё 1 53 Шарик 1
14 Пружина 1 54 Пружина рычага рамки 1
15 Корпус защелки 1 55 Предохранитель 1
16 Защелка цевья 1 56 Рычаг рамки 1
17 Штифт 1 57 Рамка 1
18-20 Винт 3 58 Пружина рамки 1
21 Ось рычагов 1 59 Ось рычага рамки 1
22 Рычаг правый 1 60 Ось 2
23 Рычаг левый 1 61 Винт 1
24 Шарнир 1 62 Личинка 1
25 Пружина рычагов 1 63 Винт 1
26 Винт 1 64 Скоба предохранительная 1
27 Коробка 1 65 Винт скобы предохранительной 1
28 Кулачок 1 66 Крючок спусковой левый 1
29 Ось кулачка 1 67 Пружина крючков спусковых 2
30 Ось шептал 1 68 Крючок спусковой правый 1
31 Шептало левое 1 69 Штифт 1
32 Курок собранный левый 1 70 Приклад 1
33 Заглушка 2 71 Винт 1
34 Винт заглушки 2 72 Шайба 1
35 Подаватель 1 73 Затылок приклада 1
36 Шток собранный левый 1 74-75 Шуруп 2
37 Шток собранный правый 1 76 Основание антабки приклада 1
38 Взводитель 2 77 Пружина шептал 2
39 Ось взводителей 1 78 Груз 1
40 Винт 1 79 Штифт 2
41 Рычаг запора 1 80 Пружина предохранителя 1

Перечень сборочных единиц и деталей ружья ИЖ-43 приведён в табл.3.

Обозначение на рис. 2 Наименование Кол-во на изделие
1 Стволы собранные 1
2 Выбрасыватель 1
3 Штифт выбрасывателя 1
4 Шарнир 1
5 Подаватель 1
6 Цевьё 1
7 Коробка 1

Примечание. Остальные детали не отличаются от деталей ружья ИЖ-43Е.

Перечень сборочных единиц и деталей ударно-спускового механизма ружей ИЖ-43 и ИЖ-43Е приведён в табл.4.

Обозначение на рис. 3 Наименование Кол-во на изделие
1 Коробка 1
2 Крючок спусковой левый 1
3 Крючок спусковой правый 1
4 Шептало левое 1
5 Шептало правое 1
6 Предохранитель с чекой 1

Примечание. Остальные сборочные единицы и детали ружья ИЖ-43 с автономными спусковыми крючками не отличаются от сборочных единиц и деталей ружья ИЖ-43 с универсальным УСМ.

Примечание. Остальные сборочные единицы и детали ружья ИЖ-43Е с автономными спусковыми крючками не отличаются от сборочных единиц и деталей ружья ИЖ-43Е с универсальным УСМ.

Перечень деталей ударно-спускового механизма ружей ИЖ-43-1С и ИЖ-43Е-1С приведён в таблице 5.

Обозначение на рис. 4 Наименование Кол-во на изделие
1 Шептало левое 1
2 Шептало правое 1
3 Крючок спусковой 1
4 Пружина 1
5 Гнеток кнопки 1
6 Кнопка переключателя 1

Примечание. Остальные детали ружей ИЖ-43-1С и ИЖ-43Е-1С не отличаются от сборочных единиц и деталей ружей ИЖ-43 и ИЖ-43Е с универсальным УСМ.

Ружья под патрон «Магнум» ИЖ-43-М, ИЖ-43Е-М, ИЖ-43-1 С-М, ИЖ-43Е-1С-М могут изготовляться со втулками бойков (см. рис. 5, 6) или с обычными курками с бойками уменьшенного диаметра (см. рис. 1).

Перечень сборочных единиц и деталей ружей ИЖ-43-1С-М, ИЖ-43Е-1С-М приведен в табл. 6.

Обозначение Рисунок Наименование Кол-во на изделие
1 5 Коробка 1
2 5 Втулка бойка собранная 2
3 5 Курок левый собранный 1
4 5 Курок правый собранный 1
5 5 Стволы собранные 1
6 5 Винт 2
7 5 Приклад 1
12 1 Цевьё 1
24 1 Шарнир 1

Примечание. Остальные сборочные единицы и детали ружей ИЖ-43-1С-М и ИЖ-43Е-1С-М не отличаются от сборочных единиц и деталей ружей ИЖ-43-1С и ИЖ-43Е-1С.

Перечень сборочных единиц и деталей ружей ИЖ-43-М и ИЖ-43Е-М приведён в таблице 7.

Обозначение Рисунок Наименование Кол-во на изделие
1 6 Коробка 1
2 6 Втулка бойка собранная 2
3 6 Курок левый собранный 1
4 6 Курок правый собранный 1
5 6 Стволы собранные 1
6 6 Винт 2
7 6 Приклад 1
12 1 Цевьё 1
24 1 Шарнир 1

Примечание. Остальные сборочные единицы и детали ружей ИЖ-43-М и ИЖ-43Е-М не отличаются от сборочных единиц и деталей ружей ИЖ-43 и ИЖ-43Е с автономными спусковыми крючками.

Вывод

Вы опытный стрелок, предпочитающий охотиться с комфортом и колоритом? Готовитесь к долгому переходу и подбираете соответствующее снаряжение? Смело берите «двадцатку», причем в целях экономии вполне подойдет ИЖ-58. Но если вы только решили постичь все прелести охоты на дичь и не хотите отбить желание, то лучше взять ружье 12-го или 16-го калибра. Даже подержанная модель в хорошем состоянии поможет смело отправляться в чащу или на болота.

Возникли сомнения относительно выбора ружья? Рекомендуется заручиться поддержкой знающего человека. Один из вариантов — спросить у продавца в магазине, какие российские/зарубежные модели «двадцатки» пользуются наибольшим спросом и что говорят о них владельцы. Это поможет сделать правильный выбор в пользу качественного ружья 20-го калибра.

Левша. Двуствольное ружьё МР-43 КН орех, 12/70 510 мм

Двуствольное ружьё МР-43 КН орех, 12/70 510 мм

Производитель: Baikal

Артикул: 00-00001040

Код производителя: 9312130186

Двуствольное ружьё МР-43 КН орех, 12/70 510 мм.с горизонтальным расположением стволов.

Это ружье — обновленное поколение некогда популярного охотничьего ружья ИЖ-43, выпущенного в 1986 году.

В конструкции ружья МР-43 используются прочные современные материалы, при этом в нем сохранен облик классического двуствольного ружья с горизонтальным блоком стволов. В качестве прицельного приспособления МР-43 — механический прицел. Затыльник — пластиковый. Каналы стволов хромированы.

Цена и надежная простая конструкция делают это ружье отличным вариантом покупки для начинающего охотника.

Преимущества:

  • Надежная система с запиранием на два подствольных крюка рамкой Пердэ
  • Хромированные каналы стволов и патронников
  • Прицельные приспособления с вентилируемой планкой и мушкой
  • Цевье и приклад из дерева
  • Приклад с амортизирующим резиновым затыльником

 

 

МР-43 КН, УСМ, двустволка

МР-43 КН — из линейки моделей МП-43. Относится к спусковому крючку гладкоствольного ружья, в котором есть возможность изменять сужение дульного сужения. Выпускается с ножками разной длины, что только увеличивает его популярность.

Гладкоствольная «горизонтальная» выпускается Ижевским механическим заводом более 55 лет. Прочная конструкция, надежная работа и отличные боевые характеристики обеспечивают неизменную популярность продукта. МР-43 КН — единственное в России спусковое двуствольное ружье, имеющееся в продаже.

Обзор ружья МР-43 КН

МР-43 КН или ИЖ-43, как их раньше называли — классическое охотничье ружье с горизонтально расположенными стволами и выставленными курками. Эта особенность и накладные панели придают неповторимый шарм. После 1990 г. выпуск Тульской спусковой винтовки ТОЗ-80 был прекращен, МР-43 КН — единственный вариант, классический охотничий образец.

Споры о качествах корковых и ружья не утихали никогда. Но даже после исчезновения возможности сравнивать выяснилось, что «Марковка» по-прежнему популярна и не из-за оригинального внешнего вида.

МР-43 КН по сравнению с предшественником имеет определенные конструктивные отличия. В частности, ударно-спусковой механизм, не позволяющий произвести выстрел без полного нажатия на спусковой крючок. Максимальное внимание уделяется безопасности изделия: конструкция внешних курков не позволяет произвести выстрел при внешнем ударе по спусковому крючку.

Произведено несколько модификаций изделия. Наибольший интерес у охотников вызывает модель с предельно коротким стволом для охоты на перепелов.10 лет назад, когда появился дробовик МР-43 КН, это была настоящая революция на российском рынке.

Чем отличается двуствольный перфоратор МР-43Х, недостатки, будут описаны ниже.

Преимущества и недостатки

МР-43 КН — ружье горизонтальное с возможностью смены ствола. Эта конструкция предполагает особый узел подключения ствола к коробке, а также специфику спускового крючка. Ижевский механический завод (он же «автор» таких моделей, как МП-94 «Экспресс», МП-133, МП-233, МП-18МН, «Север», МП-161К, МР-142К, МР-143, ОП- СКС и др.) для создания спортивной винтовки. решить эти проблемы самостоятельно.

К достоинствам ружья следует отнести следующие характеристики.

  • Превосходная кучность при любой длине ствола и стандартной модели, а также ружье с укороченным стволом с 35 м наводятся на цель диаметром 5-6 см. При квалификации рукой можно добиться лучших результатов.
  • Винтовка
  • является прекладателу. Приклад дерева пропитан маслом, на прикладе закреплен пластиковый затыльник — лучший вариант для стрельбы навскидку.
  • Стволы МР-43 КН выпускаются с различным дульным сужением от цилиндра с нулевым сужением до сужения до 1 мм. Пушка изготовлена ​​из высокопрочной стали. Стволы поставляются с цевьем в сборе. На сменном стволе и шарнире указывается порядковый номер ствола. На блоке ствола сцепления указывают сокращение. Поверхность окислена. Отличная обработка и сверление всегда были отличительной чертой винтовок Ижевского завода.

Стволы соединены с предкрылками, в казённой части — муфтой ствольной коробки. В отличие от предыдущей модели, в MP-43 KN отсутствует верхний крючок, который ранее использовался для предотвращения поворота. Его устранение обеспечило большую площадь, примыкающую к разрезу стволов к пульту управления, что в свою очередь повысило защищенность ружья.

  • Двойное запирание, очень надежное, производится фиксацией фиксирующих планок на 2-х подствольных крючках. Рука запора фиксируется на головке рычага фиксирующей планкой.
  • УСМ оригинальной конструкции располагается на отдельной личинке. Нападающие проводятся отдельно от Куркова. Винт боевой пружины и упор на шкворне собраны как отдельный блок. При открытии стволов, пружины сжатия и взведения курков автоматически. Выстрел без отжима крючков осуществить не удалось.

Главной особенностью конструкции является то, что оба водителя в виде крючков универсальны и позволяют вести огонь из обоих стволов. Спереди выполняет последовательность справа-налево, а сзади — слева-направо.Стрелять можно обычным способом, то есть поочередно поворачивая палец на спусковом крючке. Не все модели были укомплектованы УСМ-ом Калинина — описываемого типа. Кроме того, в 90-х годах производилось ружье с одинарным спусковым крючком.

  • На МР-43 КН на хвостовике ящика установлен автоматический предохранитель, подпружиненный. Предохранитель блокирует шептало и спусковой крючок спускового крючка, то есть не только выстрелить, но и просто спустить курок невозможно.
  • МР-43 КН, а все спусковые крючки оружия разрешено хранить и транспортировать боеприпасы в патроннике, поскольку боеприпас не ослабляет боевую пружину.

Срок эксплуатации не менее 15 тысяч выстрелов.

Недостатки модели тоже есть.

  • Внешний триггер вызывает нарекания из-за своей излишней тонкости, даже деликатности. Кроме того, оси смещены крючками под подушки стволов.
  • Слишком низкое усилие на спусковой крючок.
  • Очень сильный удар и подбрасывание. С непривычки ружье сложно держать в руках, поэтому к обращению с ним нужно привыкнуть.

Фото винтовок МР-43КН и ИЛ-43КН

Назначение

12 калибра, вероятно, самый популярный среди охотников, поскольку он чрезвычайно универсален.Отправляйтесь с ним на мелкую дичь, такую ​​как кролик, луговая собачка, а в средней — на лису, оленя, волка и птицу. МР-43 КН соответствовал своему назначению.

  • Различная длина валов позволяет использовать модель для беговой охоты из засады. В целом ружье предназначено для ловли зверя в кустах, где обзор ограничен, а расстояние до цели невелико.
  • МР-43 КН может использоваться для самообороны. Здесь может быть очень полезно слабое нажатие на спусковой крючок и возможность стрелять с одного спускового крючка.
  • Модель с укороченным стволом для стрельбы по птицам, в частности по перепелам. Данная модификация изначально задумывалась как импортная, однако на российском рынке была востребована.
Разновидности

МР-43 КН — модель МП-43. Это единственный вариант спускового крючка оружия со сменными стволами. Рассчитан на 12 калибр.

На самом деле есть его модификации, но разная длина ствола позволяет выбрать оптимальный вариант для разных видов охоты.Длина ствола может составлять 750 мм, 725 мм, 610 мм и 510 мм. ultrashort in Этот параметр влияет на выбор боеприпасов.

Технические характеристики

Кучность боевого гладкоствольного ружья проверяют только патроны, заряженные картечью. Кучность при стрельбе пулями не регламентируется.

Опция Значение параметра
Калибр 12
Длина ствола, мм 510, 660, 725, 750
Длина камеры, мм 70
Диаметр канала ствола, условный, мм 18,4
Величина сужения штуцера, мм 0,0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0
Приклад и цевье Береза, орех, бук
Масса, кг 3,4

Вес заряженного ружья.

Проект

Конструкция МР-43 КН аналогична устройству остальных дробовиков линейки, но является устройством ударно-спускового механизма. Точнее разница между теми моделями, в которых был установлен УСМ Калинин.
Остальные узлы винтовки идентичны МР-43.

  • Стволы съемные, расположены в горизонтальной плоскости. Для повышения скорострельности каналы ствольной коробки и патронник хромированы.

Запирание стволов происходит при фиксации фиксирующих планок на 2 подствольных крюках.Управляйте механизмом с помощью рычага, расположенного в верхней части ствольной коробки. Разблокировка происходит при повороте рычага вправо.

  • Съемное цевье фиксировано рычажным защелкивающимся типом. Защелка и петля усилены и фиксируются 3 винтами.
  • Гильза из патронника, толкающего эжектора — один на два патрона. Он кладет отработанные гильзы, но не забрасывает. Окончательная утилизация осуществляется вручную.
  • УСМ Калинина с возвратным выносным спусковым крючком «погаснет».На территории Куркова есть взводы безопасности. Нападающие сделаны отдельно. Взведение производится вручную. Возможен безударный спуск спускового крючка со взвода. Удерживая триггеры, нажмите на триггеры и переместите триггер вперед. Затем отпустите крюки и спусковые крючки наденьте взводы облегчения.

Спуск производит два триггера: передний, отвечающий за компоновку, правый-левый, задний — левый-правый.

Обеспечивает механизм блокировки выстрела при не нажатом спусковом крючке.В коробке есть рамный замок, ограничивающий ход плашек. При нажатии на спусковой крючок рамка освобождает курок.

  • Автоматический предохранитель срабатывает при открытии: запирает шептало и крючки. Переднее положение кнопки указывает на то, что режим «выключен», заднее — «включен».
  • Приклад крепится к центру между личинкой и хвостовиком ложи, передний конец предварительно натягивается стяжным винтом. Затяжной винт на заднем конце закрывает заднюю панель.

Ружье, предназначенное для стрельбы боеприпасами, длина которых не превышает длину патронника, указанную на стволах. Относится к длине скручиваемой гильзы. Нельзя стрелять пулями, диаметр которых больше диаметра канала ствольной коробки в месте сужения. Диаметр пули должен быть на 0,2–0,3 мм меньше. Ни в коем случае нельзя использовать пули из твердых материалов — стали, латуни.

Оборудование

Ружье МР-43 КН поставляется в собранном виде. Перед сборкой тщательно очистите детали от заводской смазки.

Стандарт прост:

  • коробка картонная;
  • паспорт товара;
  • возможно доукомплектовать сменным стволом в сборе с цевьем -0,25, 0,5 и 1,0 мм.В этом случае в комплект входит ключ для смены ствола.
Принцип работы

Конструкция ружья проста, очень неприхотлива, поэтому ключом при обращении с ружьем не является приложение чрезмерных усилий. При правильной реализации усилий пользователя не требуется.

Зарядка карабина следующая:

  • поверните фиксатор вправо до упора;
  • повернуть стволы вниз до упора;
  • последовательно ставил пули в патронник;
  • верните штанги в исходное положение.Рычаг расцепления должен занимать центральное положение, если ориентироваться на хвостовик. В противном случае рычаг регулируется вручную.

Особое внимание следует уделить манипуляциям со сменными дросселями. В этой процедуре необходимо выполнить ряд требований:

  • все манипуляции проводить только на разряженном ружье;
  • перед каждым выстрелом и после изменения сокращения, чтобы проверить, насколько хорошо продолжалось сокращение. Для затяжки используйте специальный ключ из комплекта.При недостаточной затяжке пороховых газов газы прорываются в зазор между перетяжкой и стволом, что приводит к деформации деталей и даже вылету сужения;
  • сменное дульное сужение должно быть ровным по отношению к морде или немного утонуть;
  • дульное сужение прикручено до упора выступа на стволе, но между стволом и сужением зазор остается;
  • после установки канал посещает: в точке соприкосновения конца сужения и выступа канала должно быть видно кольцо.Если целостность кольца, это означает деформацию перетяжки или посадочного места. Стрельба в этом случае запрещена.

Герметичность морды от схваток нужно проверять после 50-100 выстрелов.

Разборка

Для ухода за винтовкой периодически выполняйте процедуру частичной разборки. Порядок действий следующий:

  • осмотреть патронник на предмет пуль. Снимите их;
  • потяните защелку цевья за нижнюю поверхность и отверните передний конец цевья от ствола.Отсоедините хвостовик;
  • поверните рычаг запора в верхней части коробки вправо. Поверните ствол вниз до упора и отсоедините его от коробки;
  • , если вы хотите очистить и смазать ударно-спусковой механизм, действуйте следующим образом: Отвинтите винты и отделите головку от приклада, поверните стопорный винт и снимите втулку. Открутите винт, проходящий через приклад, а затем слегка ударьте ложей о деревянную поверхность, чтобы ослабить соединение приклада и ложи.Затем снимите окурок.

Если вы собираетесь хранить или носить ружье, цевье крепится к снятым стволам.

Сборка МР-43 КН производится в обратном порядке. Полная разборка требуется только в случае повреждения или очень грязного оружия.

Для чистки и смазки понадобится оружейное масло, ветошь, щетка и чистящий стержень.

Тюнинг

Большое поле деятельности по тюнингу нет. Можно заменить приклад на деревяшку или на более интересный орнамент.

  • На приклад рукоятки можно установить антабку для быстросъемной антабки.
  • Хороший вариант — патронташ на несколько патронов в подсумке на прикладе.

Отзывы владельцев и цена на двуствольное ружье ударное МР-43Х (МП-43 КН) 510, 725 и др. Описаны ниже.

Цена
Стоимость

МР-43 КН вполне доступна, составляет от 21000 до 17450 р. Длина ствола мало влияет на ценообразование.

Стоимость патронов в зависимости от баллистических характеристик колеблется от 15 до 58 рублей за 1 штуку

Обзоры

Любители традиционного спускового крючка этого пистолета считаю модель вполне удачной, несмотря на излишнюю тонкость и легкость спускового крючка.Не менее привлекательной является возможность устанавливать морду разными сокращениями.

Длина ствола была второй наиболее привлекательной особенностью. Модель с укороченным стволом — 510 мм, была впереди всех остальных, как незаменимая для охоты на небольшую птицу.

В любом случае есть высокая точность, как стандартные дистанции, так и более значительные — 50 м.

Честный отзыв на местный Двуствольный (ИЖ-58, собственно ИЖ-43). Жду ответа со стороны разработчика.: rs2vietnam

Краткое вступление:

Как большой поклонник дробовиков и обладатель 5 штук разного типа и происхождения, мне нравится наблюдать за 12-м калибром в играх, это может считаться моим дополнительным странным хобби. RS2: V, конечно, привлекло мое внимание, так как он показывает 12ga в довольно хорошем свете, но все же я замечаю довольно много заблуждений и недоразумений, что немного печально.

Около полгода назад я сделал сообщение по этой теме на странице сообщества Steam, но не получил достаточного внимания, ни официального ответа, ни разъяснений.На этот раз я сделал более крупный обзор с лучшими материалами и постараюсь продвинуть его дальше здесь, на Reddit.

Теперь перейдем непосредственно к теме.

Вы можете узнать вещь, которую я держу в руках, обратите внимание, как она выглядит иначе. IRL:

POV. Обратите внимание на цвет, это темный металлик, который довольно сильно светится, в солнечный день вы с трудом узнаете края стволов, поскольку они легко отражают весь падающий свет.

Открытое действие. Обратите внимание на элемент между пустыми оболочками, который называется экстрактором.Экстрактор просто немного выталкивает раковины во время открывания для облегчения извлечения раковин.

Это советский ИЖ-43 1991 года выпуска. Позже он будет переименован в МП-43 для облегчения экспорта на внешние рынки. Единственная разница между тем, что у меня есть, и игрой в том, что у RS2 есть ИЖ-43 с Эжектором, а у меня более простая версия с Экстрактором. Позже я объясню, почему это важно и как это повлияет на производительность.

  1. Общая логика и смысл

Нет, Советы никогда не поставили бы ни одной просоветской стране гражданское гладкоствольное охотничье оружие, верьте мне или нет.

Такие ружья экспортировались и продавались за границу, в основном в Европу, большая часть по-прежнему предназначалась для внутреннего рынка, но никак не могла попасть во Вьетнам. Поскольку в руках Вьетконга находится французское оружие, вероятность обнаружить SxS французского или, скажем, бельгийского производства будет выше, чем чего-либо советского.

Еще один вопрос — снаряды 12ga для вьетконговской стороны. Единственный источник, о котором я могу думать, — это грабежи с трупов солдат, что само по себе довольно абсурдно.

2. Нейминг и моделирование

Но ладно, несмотря на сомнительные причины, разработчики все же решили добавить в игру советский SxS.

Фактическая модель, которая присутствует в игре, — ИЖ-43Э (современное название — МП-43). Базовый вариант охоты, очевидно, с 72-сантиметровыми стволами и эжектором, как показано на следующем рисунке:

Точное название игры SxS будет ИЖ-43…, где «E» означает Эжектор.

ИЖ-43 — продолжение ИЖ-58. 43 был спроектирован в течение 1984 в Ижевске А.Н. Калинин. Очевидно, это не совсем то же самое, что и эпоха войны во Вьетнаме. Узнав об этом, разработчики, по-видимому, решили изменить его название на ИЖ-58, которое так или иначе попадает в эпоху, но все же модель изображает ИЖ-43.

Так выглядит модель 58:

2 больших отличия между 43 и 58: кнопка безопасности и блокировка.

Основные различия между 43 и 58 моделями, которые легко заметить:

— В отличие от 43, 58 имеет тройной механизм блокировки. Вы можете заметить блокирующий блок прямо над экстрактором между стволами на картинке выше.43 не имеет такого элемента, только с двойной блокировкой.

— Кнопки безопасности разные. Вы можете сравнить изображения, чтобы увидеть формы кнопок.

3. Визуальные эффекты

Как видите, в игре дробовик изображен матово-серым цветом, что довольно странно. Я не большой фанат графики, на самом деле это не так уж важно, но должен сказать об этом, чтобы донести больше правды до умы тех, кто играет. Только учтите: в реале это выглядит совершенно иначе.

Вы можете еще раз посмотреть изображения выше, чтобы сравнить визуальные эффекты.

4. Механика работы

— Игровой ИЖ имеет выталкиватель, но не работает должным образом. Эжектор — это механизм, который, в отличие от экстрактора, полностью выбрасывает гильзы при открытии. Другими словами, снаряды просто вылетают из камер. Многие не считают ее особенно полезной для реальной охоты, но довольно широко распространены в Спортинге. Это может быть неплохо для войны, так как вы не хотите, чтобы снаряды терялись. Механизм также довольно ненадежный, особенно на старых SxS-дробовиках, многие охотники предпочитают отключать его вручную.

// вы можете сказать, что он отключен, ладно, принимайте это как истину

— Обе модели имеют автоматическое включение безопасности при срабатывании защиты. Его также можно отключить вручную во время полной разборки (не во время полевой разборки).

// здесь то же самое, немного точных деталей, можно сказать, что он тоже отключен.

5. Механика стрельбы и паттерн, правильные патроны

— Дроссели и их роль в формировании схемы выстрела. Давайте посмотрим на следующую картинку:

Маркировка штуцеров на стволах.

Поверьте мне, 95% когда-либо выпущенных моделей 43 и 58 имели такую ​​схему ствола: правый ствол имел бы 0,5 чок (половинный чок), а левый — 1,0 чок (полный чок). Интернет вам очень поможет, если вы ничего не слышали о дросселях и их роли в гладкоствольных трубах.

Поскольку советские и европейские ружья SxS были в первую очередь предназначены для охоты на птиц, эти ружья не очень любят крупную дробь и пули большого калибра. Карту №4 можно использовать из обоих стволов, но заводской вариант 00 баксов не подходит для такого ружья (имеется в виду 3 ряда по 3 штуки в каждом).Существует вероятность того, что ствол будет поврежден при стрельбе пулей калибра или 00 баксов, так как конец ствола будет слишком тугим. Самозарядные снаряды с зарядом 00 баксов (4 ряда по 2 светодиодных шара в каждом) могут исключить шанс повредить стволы, но кто когда-либо делал перезарядку во время войны во Вьетнаме? Сторона

GI не имеет этой проблемы, поскольку их Ithacas имеют стволы с цилиндрическим отверстием (0,0) и могут легко грызть любые патроны.

Удивительно, но дроссели влияют на формирование последовательности выстрелов. Я почти уверен, что как только вы выстрелите двумя стволами в стену, скажем, на 50 м, схемы в игре не будут отличаться, в то время как они должны быть.Может быть, эта игра станет первой в мире, в которой действительно будет реализована эта механика?

Buckshot не любит чоковые штуцеры, поскольку, в отличие от цилиндрических отверстий, они заставляют его концентрироваться на конце ствола и затем быстрее рассеиваться, что приводит к более сильным узорам на расстоянии. Тем не менее, они хороши для съемки меньшего размера. Раньше у TOZ были довольно строгие чокеры на двуствольных стволах (1.25+), охотники много жаловались на то, что трудно сбить птицу с приличных и больших дистанций с той малогабаритной схемой, которая есть у таких чушек. сделали.При получении добычи на более близких расстояниях имелся шанс полностью ее расчленить.

При ближайшем рассмотрении намордники кажутся различающимися по диаметру.

Что касается пули, то в ту эпоху охотники с ружьями типа ИЖ обычно использовали малокалиберные не заводские пули, например, 16-калиберные, для обеспечения сохранности стволов. В отличие от нас, пули в пластиковом корпусе не использовались, и их можно безопасно использовать с любым дросселем. Я возьму пулю «Полева» в качестве примера такой пули, которая может быть достаточно точной на дистанции до 100 м с любым дробовиком:

Пули современные стальные «Полева», 12га.

Какие пули используются в игре силами Вьетконга, для меня полная загадка, как и где они вообще берут патроны 12ga.

Еще кое-что, чтобы добавить к этой смеси мыслей: идеальная длина ствола для пули 12ga составляет 51 см. Было доказано, что газы в более длинных стволах имеют тенденцию приводить к нестабильности траектории пули, что приводит к ухудшению точности. Почти все современные стволы диаметром 51 см оснащены прицельными приспособлениями для облегчения прицеливания.

— Диапазоны

Имейте в виду, что патроны 12ga обладают чудовищной энергией на близких дистанциях, но она быстро проходит.Обычно после выстрела слизняки имеют около 3000-4000 Джоулей, но эта энергия делится на 3 при входе на дистанцию ​​100 м. Да, для человека хватит, но сначала сделай точный удар.

Карточка будет иметь ужасную энергию и узор на 100 м +. Когда я вижу сообщения о людях, которых убивают картечью с 200 метров, я как бы бью себя по лбу до кровотечения. Вы можете найти здесь, на Reddit, хороший пост от бывшего морского пехотинца, который служил с дробовиками в Ираке. Он сказал, что иногда одного выстрела картечью даже на близких дистанциях не хватало, чтобы противник упал, что уж говорить о 200м? Есть небольшой шанс, но не переоценивайте его.Я знаю, что люди ценят лучшую производительность по сравнению с другими играми, но у вас все же должны быть некоторые логические ограничения. Но как говорят: «Deus vult».

Тем не менее, обычные пули должны быть выбором для тех, кто хочет стрелять из снайперской винтовки.

6. Звуки стрельбы

Действительно странно в этой игре. Довольно приятно для ушей игрока, согласен, но совершенно нереально.

Вот видео обозревателя, стреляющего в MP-43: https://youtu.be/2xI2DUSlyDo?t=137

Это в значительной степени то, как это звучит IRL, но поверьте мне, даже со спортивными патронами 28g вы получите немного ПТСР каждый раз, когда вы его запускаете.По крайней мере, я знаю. Имейте в виду, что один SxS с более короткими стволами обычно бьет и звучит в 1,3 раза тяжелее.

7. Предложения и заключительные слова

То, что я предлагаю разработчикам:

— Сделать дробовик безымянным, было бы простым решением всех вещей, о которых я говорил в начале. Нет настоящего названия — никаких заявлений от таких артистов, как я, относительно происхождения оружия.

— Избавьтесь от выталкивателя или принудительно вытолкните его.

— Возможно реализовать механику чока, сделать левый ствол немного меньше правого, по крайней мере, без разброса.Добавит очков к вашей карме.

— Измените текстуру пистолета, чтобы он не выглядел так, как будто он сделан из пластилина.

— По-прежнему ослабляет дальность стрельбы картечью и немного усиливает пули, ради реалистичности, к которой вы стремитесь.

— Получите лучшие звуки.

Спасибо за то, что потратили время на чтение этого документа, и благодарность тем, кто добрался до конца.

Не стесняйтесь задавать любые вопросы, если необходимы какие-либо разъяснения.

И да, все равно был бы рад получить ответ от разработчика.

EDIT: добавлена ​​звуковая часть.

EDIT2: незначительные улучшения текста, дополнительная информация о пулевых стволах.

Выбор традиционалистов-самозащитников

Охотники — люди крайне консервативные. Большинство отечественных и европейских охотников убеждены: охотничье ружье — это всего лишь дробовик. Даже самозарядные, которые в последнее время на гражданском рынке оружия явно незаметны и которые по надежности не слишком уступают «двуличным», вряд ли вписываются в эту схему. Не говоря уже о «помпе».
Между тем любители «классики» и традиций также относятся к довольно большой группе стрелков, не занимающихся охотой и практической стрельбой, которых условно называют «самозащищенными».

И некоторые из них уверены, что лучшее оружие самообороны — это двуствольное ружье с короткими стволами и внешними спусковыми крючками.

Такое оружие когда-то было, пожалуй, самым распространенным средством защиты, и появилось оно под названием сценическое или кучерское ружье, лупар и кугган.Его успешно использовали русские ямщики, защищая с его помощью от «лихих людей» и волков, «озорных» на бескрайних просторах империи, и ковбоев, и шерифов, и сицилийских пастухов, и многих-многих других.

Во время гражданской войны в США двуствольный ствол с укороченными стволами был излюбленным оружием всадников с обеих сторон. Легендарный командующий конницей Конфедерации Натан Бедфорд Форрест утверждал, что двуствольное ружье было лучшим оружием его всадников.

Надо сказать, что американская кавалерия, в отличие от своих европейских собратьев, редко применяла холодное оружие, больше опираясь на «огнестрельное оружие». Они подошли к противнику и стреляли по нему из револьверов или двустволки. У последнего было то преимущество, что выстреленной связкой было намного легче скакать по противнику. Более того, в кавалерийской схватке, когда противники скачут навстречу друг другу, стрелять больше двух раз было вряд ли, да и перезарядить дробовик было легче, чем револьвер. И, наконец, револьвер стоил намного дороже.

Двойной ствол из-за своей «бюджетности», а также большей универсальности, чем «мастерские» револьверы и карабины, пользовался популярностью среди американских мигрантов и среди русских крестьян.

Почти до середины прошлого века двуствольные ружья с короткими стволами использовались в некоторых полицейских участках, опять же из-за их эффективности.

Поклонники «двуручного» утверждают, что «малый заряд» двуствольного ружья особой проблемы не представляет, так как в случае атаки трех вооруженных противников шансы защитника равны нулю.Утверждение, с моей точки зрения, отнюдь не бесспорно.

Указанные сильные стороны — лучший баланс, чем у магазинных винтовок, отсутствие движущихся частей автоматики и высокая надежность. Двуствольный механизм закрыт в блоке и недоступен для внешних воздействий, из которых самое страшное — непрофессиональная разборка и чистка. Два ствола и два ударно-спусковых механизма дают двойную гарантию, а выход из строя одного не блокирует систему в целом.

Выстрел патрона в ствол происходит непосредственно с руки, что позволяет использовать различные патроны, в том числе несшитые. Извлечение также чрезвычайно простое, даже с помощью эжектора, выталкивающего патрон из открытого ствола, а не через окно извлечения.

Необходимость в коротких стволах вызвана не только стремлением сделать оружие самообороны максимально компактным и поворотным, но и обеспечивает достаточно широкий разброс выстрела или канистры на расстоянии около 10 м от дульного среза.При этом ружье должно обеспечивать приемлемый бой пули на дальности до 50 метров. Для калибра 12 оптимальная длина ствола — 500 мм (это минимальная длина, указанная в законе «Об оружии»). А в США длина в 510 мм (24 дюйма) является стандартной для ружей самообороны.

Важным моментом для «самообороны» является наличие внешних спусковых крючков, что дает возможность хранить или транспортировать винтовку с патронами в патронниках и без спусковых крючков, то есть в максимальной боеготовности, без риска. о «падении» пружины или о непроизвольном выстреле.Однако отметим, что хранение и транспортировка оружия с патроном в патроннике является нарушением закона.

Сегодня в России выпускается, пожалуй, только одно ружье, подпадающее под этот класс — это МР 43 КН производства Ижевского механического завода. Длина ствола — классическая 510 мм, масса — 3,4 кг. Стволы имеют цилиндрическую дрель, опционально оснащаются сменным чокером.

Любопытно, что изначально пистолет производился исключительно для США; заводчане не видели в ней перспектив на внутреннем рынке.Однако после того, как небольшая партия попала на прилавки отечественных магазинов и сразу была «заточена», ружье стали продавать в России.

Несмотря на обычные претензии к качеству продукции «Ижмех», в отношении МР-43КН часто можно услышать положительные отзывы, свидетельствующие о хороших характеристиках ружья, о хорошей стыковке дерева с металлом. Ружье отличается хорошей балансировкой и очень компактным. В разобранном виде легко помещается в любой рюкзак или дорожную сумку.

Имеет вполне приличный пулевой бой на обычных для гладкоствольного оружия дистанциях, что дает возможность использовать его при охоте на зверей.Кроме того, его успешно используют при охоте на перепелов.

Из недостатков, пожалуй, можно отметить автоматический предохранитель, который срабатывает при развороте стволов и унаследован от внутритокового прародителя — Иж-43. На ружье с внешними спусковыми крючками вещь на мой взгляд совершенно лишняя.

Собственно говоря, в настоящей нише самообороны двуствольное ружье все же уступает самозарядным и «помпам», многие из которых не уступают ему ни по компактности, ни по надежности, но уступают по скорострельности. и многозарядные.

Тем не менее, «Лупара» продолжает пользоваться спросом и даже пробивается в спорт. В частности, в США она участвует в соревнованиях по «ковбойской стрельбе» или «ковбойскому триатлону».

В России набирает обороты популярная «Махновск-кулацкая и партизанская стрельба» — шуточные матчи, где организаторы сочетают соревнования по стрельбе с костюмированным шоу. С 2006 года такие соревнования проводятся регулярно, и основное оружие на них — двойной ствол.

СЕК.gov | Превышен порог скорости запросов

Чтобы обеспечить равный доступ для всех пользователей, SEC оставляет за собой право ограничивать запросы, исходящие от необъявленных автоматизированных инструментов. Ваш запрос был идентифицирован как часть сети автоматизированных инструментов за пределами допустимой политики и будет обрабатываться до тех пор, пока не будут приняты меры по объявлению вашего трафика.

Укажите свой трафик, обновив свой пользовательский агент, включив в него информацию о компании.

Для лучших практик по эффективной загрузке информации из SEC.gov, включая последние документы EDGAR, посетите sec.gov/developer. Вы также можете подписаться на рассылку обновлений по электронной почте о программе открытых данных SEC, включая передовые методы, которые делают загрузку данных более эффективной, и улучшения SEC.gov, которые могут повлиять на процессы загрузки по сценарию. Для получения дополнительной информации обращайтесь по адресу [email protected]

Для получения дополнительной информации см. Политику конфиденциальности и безопасности веб-сайта SEC. Благодарим вас за интерес к Комиссии по ценным бумагам и биржам США.

Идентификатор ссылки: 0.67fd733e.16274.1ae9390b

Дополнительная информация

Политика безопасности в Интернете

Используя этот сайт, вы соглашаетесь на мониторинг и аудит безопасности. В целях безопасности и обеспечения того, чтобы общедоступная услуга оставалась доступной для пользователей, эта правительственная компьютерная система использует программы для мониторинга сетевого трафика для выявления несанкционированных попыток загрузки или изменения информации или иного причинения ущерба, включая попытки отказать пользователям в обслуживании.

Несанкционированные попытки загрузить информацию и / или изменить информацию в любой части этого сайта строго запрещены и подлежат судебному преследованию в соответствии с Законом о компьютерном мошенничестве и злоупотреблениях 1986 года и Законом о защите национальной информационной инфраструктуры 1996 года (см. Раздел 18 U.S.C. §§ 1001 и 1030).

Чтобы обеспечить хорошую работу нашего веб-сайта для всех пользователей, SEC отслеживает частоту запросов на контент SEC.gov, чтобы гарантировать, что автоматический поиск не влияет на возможность доступа других лиц к контенту SEC.gov. Мы оставляем за собой право блокировать IP-адреса, которые отправляют чрезмерное количество запросов. Текущие правила ограничивают пользователей до 10 запросов в секунду, независимо от количества машин, используемых для отправки запросов.

Если пользователь или приложение отправляет более 10 запросов в секунду, дальнейшие запросы с IP-адреса (-ов) могут быть ограничены на короткий период.Как только количество запросов упадет ниже порогового значения на 10 минут, пользователь может возобновить доступ к контенту на SEC.gov. Эта практика SEC предназначена для ограничения чрезмерного автоматического поиска на SEC.gov и не предназначена и не ожидается, чтобы повлиять на людей, просматривающих веб-сайт SEC.gov.

Обратите внимание, что эта политика может измениться, поскольку SEC управляет SEC.gov, чтобы гарантировать, что веб-сайт работает эффективно и остается доступным для всех пользователей.

Примечание: Мы не предлагаем техническую поддержку для разработки или отладки процессов загрузки по сценарию.

Страница не найдена | MIT

Перейти к содержанию ↓
  • Образование
  • Исследовательская работа
  • Инновации
  • Прием + помощь
  • Студенческая жизнь
  • Новости
  • Выпускников
  • О MIT
  • Подробнее ↓
    • Прием + помощь
    • Студенческая жизнь
    • Новости
    • Выпускников
    • О MIT
Меню ↓ Поиск Меню Ой, похоже, мы не смогли найти то, что вы искали!
Попробуйте поискать что-нибудь еще! Что вы ищете? Увидеть больше результатов

Предложения или отзывы?

A Система анализа Saccharomyces cerevisiae для исследования взаимодействий лиганд / AdipoR1, которые приводят к передаче сигналов в клетках

Abstract

Адипонектин — это гормон млекопитающих, который оказывает антидиабетическое, противораковое и кардиозащитное действие за счет взаимодействия с его основными повсеместно экспрессируемыми рецепторами, локализованными на плазматической мембране, AdipoR1 и AdipoR2.Здесь мы сообщаем о методе на основе Saccharomyces cerevisiae для исследования взаимодействий агонист-AdipoR, который поддается высокопроизводительному масштабированию и может использоваться для изучения обоих AdipoR по отдельности. Взаимодействия агонист-AdipoR1 выявляются с помощью анализа расщепленной люциферазы светлячка, основанного на восстановлении активности люциферазы светлячка (Luc) за счет сопоставления ее N- и C-концевых фрагментов, NLuc и CLuc, за счет лиганд-индуцированного взаимодействия химерных белков CLuc-AdipoR1. и APPL1-NLuc (адаптерный белок, содержащий домен гомологии плекстрина, фосфотирозин-связывающий домен и мотив лейциновой молнии 1-NLuc) в S.cerevisiae , лишенный дрожжевого гомолога AdipoRs (Izh3p). Анализ отслеживает самый ранний из известных этапов антидиабетического сигнального каскада адипонектин-AdipoR. Мы демонстрируем, что восстановленная активность Luc может быть обнаружена в колониях или клетках с помощью камеры CCD и количественно определена в клеточных суспензиях с помощью считывающего устройства для микропланшетов. Взаимодействие AdipoR1-APPL1 происходит в отсутствие лиганда, но может специфически стимулироваться агонистами, такими как адипонектин и осмотин белка табака, который, как было показано, обладает AdipoR-зависимой адипонектин-подобной биологической активностью в клетках млекопитающих.Чтобы дополнительно подтвердить этот анализ, мы смоделировали трехмерные структуры комплексов рецептор-лиганд встроенного в мембрану AdipoR1 с циклическими пептидами, полученными из осмотина или осмотиноподобных растительных белков. Мы демонстрируем, что рассчитанные энергии связывания AdipoR1-пептида коррелируют со способностью пептидов вести себя как агонисты AdipoR1 в анализе расщепленной люциферазы. Кроме того, мы демонстрируем агонист-AdipoR-зависимую активацию передачи сигналов протеинкиназы A (PKA) и фосфорилирование AMP-активированной протеинкиназы (AMPK) в S.cerevisiae , которые гомологичны важным сигнальным путям адипонектин-AdipoR1 млекопитающих. Эта система должна способствовать разработке терапевтических изобретений, направленных на физиологию адипонектина и / или AdipoR.

Образец цитирования: Aouida M, Kim K, Shaikh AR, Pardo JM, Eppinger J, Yun D-J, et al. (2013) Система анализа Saccharomyces cerevisiae для исследования взаимодействий лиганд / AdipoR1, которые приводят к передаче сигналов в клетках. PLoS ONE 8 (6): e65454.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454

Редактор: Мин Тат Линг, Технологический университет Квинсленда, Австралия

Поступила: 30 ноября 2012 г .; Дата принятия: 21 апреля 2013 г .; Опубликовано: 7 июня 2013 г.

Авторские права: © 2013 Aouida et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Это исследование было частично поддержано фондами Университета науки и технологий имени короля Абаллы, KAUST-GCR (стипендия ARS: FIC / 2010/07), Администрации сельского развития для программы нового поколения BioGreen 21 ( Центр систем и синтетической агробиотехники, № PJ008025), Республика Южная Корея, и Министерство образования, науки и технологий для программы World Class University (WCU) (R32-10148), Республика Южная Корея. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что принадлежность MLN к Bio-Write, LLC не представляет конфликта интересов в презентации, рецензировании, редакционном решении или публикации этой рукописи. Это не влияет на соблюдение авторами всех политик PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами. Ни у кого из других авторов нет потенциальных конкурирующих интересов. Нет никаких патентных заявок или продуктов в разработке или проданных продуктов, основанных на результатах, приведенных в этой статье.

Введение

Адипонектин — это белковый гормон, секретируемый жировой тканью у млекопитающих, и он играет решающую роль в регуляции метаболизма глюкозы и липидов, воспаления и окислительного стресса [1], [2], [3], [4]. Миссенс-мутации в гене адипонектина связаны с заболеваемостью диабетом 2 типа [5], [6]. Снижение сывороточных концентраций адипонектина коррелирует с ожирением, диабетом 2 типа, сердечно-сосудистым риском, а также повышенным риском некоторых типов рака [7], [8], [9].Введение рекомбинантного адипонектина или генетическая сверхэкспрессия адипонектина на моделях грызунов оказывает терапевтическое действие при диабете, ишемическом повреждении сердца и при раке толстой кишки [10], [11], [12], [13], [14], [15], [ 16]. Эти открытия вызвали большое внимание, уделяемое адипонектину сегодня, и поддержку разработки терапевтических средств, основанных на замещении адипонектина.

Адипонектин представляет собой белок 30 кДа, который состоит из N-концевого домена коллагена и C-концевого глобулярного домена C1q [3].Это очень распространенный сывороточный белок. В сыворотке адипонектин гликозилирован и существует в виде тримеров, гексамеров и олигомеров более высокого порядка. Глобулярный домен C1q может высвобождаться путем протеолиза и является биологически активным, но он не обнаруживается в значительных количествах в сыворотке крови. Несколько исследований in vitro, и in vivo, показали, что два белка, AdipoR1 и AdipoR2, служат основными рецепторами адипонектина [11], [17]. AdipoRs и рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), имеют топологию 7-трансмембранных проходов, но функционально различны.Также, как члены семейства PAQR (Progestin and AdipoQ Receptor), AdipoRs имеют цитозольный N-конец и внешний C-конец, что является противоположной ориентацией классических GPCR [18].

Сигнальные пути, активируемые адипонектином, зависят от (а) молекулярной формы (статуса гликозилирования и степени олигомеризации) адипонектина, поскольку разные формы проявляют селективность в отношении двух AdipoR, (b) относительной численности двух AdipoR, поскольку рецепторы проявляют селективность в отношении нижестоящей передачи сигналов и (c) ткани-мишени [17], [19], [20], [21].Например, AdipoR1 действует как рецептор с высоким сродством к глобулярному адипонектину и имеет более низкое сродство к адипонектину полной длины, тогда как AdipoR2 обладает средним сродством к этим вариантам адипонектина [21]. В клетках скелетных мышц антидиабетический эффект адипонектина опосредуется стимуляцией окисления глюкозы посредством пути , активируемого протеинкиназой (AMPK), и увеличением окисления жирных кислот через путь , AMPK и рецептор, активируемый пролифератором пероксисом α (PPARα) пути [3], [20].В печени антидиабетическое действие адипонектина связано с усилением глюконеогенеза через активацию AMPK, тогда как стимуляция окисления жирных кислот, уменьшение воспаления и повышенная чувствительность к инсулину достигаются через путь PPARα [17]. В эндотелиальных клетках сосудов адипонектин оказывает противовоспалительное действие за счет увеличения продукции оксида азота, подавления окислительного стресса и подавления воспалительной передачи сигналов [22]. Эти противовоспалительные эффекты адипонектина в эндотелии сосудов объясняются активацией AMPK и циклическим AMP-протеинкиназным путем A (цАМФ-PKA).В кардиомиоцитах защитные эффекты адипонектина опосредуются передачей сигналов AMPK и циклооксигеназы 2 [22]. AdipoR1 оказывает основной эффект в опосредовании антидиабетического действия адипонектина в скелетных мышцах, тогда как оба AdipoR играют важную роль в его антидиабетическом действии в печени [17], [20].

Эти исследования показывают, что идентификация агонистов AdipoR в качестве терапевтических агентов имеет большое значение. Также очевидно, что идентификация сигнальных путей, специфически активируемых взаимодействием между агонистом и одним из AdipoR, может предоставить ценную информацию для разработки терапевтических агентов.Мы пришли к выводу, что система, разработанная для проведения таких исследований на почкующихся дрожжах Saccharomyces cerevisiae , будет сочетать в себе несколько преимуществ, подробно описанных ниже.

Во-первых, реакции и стадии регуляции метаболизма глюкозы и липидов очень похожи в клетках дрожжей и млекопитающих [23]. Энергетический метаболизм S. cerevisiae связан с метаболизмом глюкозы и липидов через теми же путями, которые существуют в клетках млекопитающих. Важно отметить, что AMPK млекопитающих и S.cerevisiae имеют сходную структуру субъединиц [24], 25. S. cerevisiae и AMPK млекопитающих могут перекрестно активироваться соответствующими вышестоящими киназами из-за сходства последовательностей между соответствующими субъединицами. S. cerevisiae и AMPK млекопитающих играют сходную роль в уравновешивании потребности в энергии с поставкой энергии за счет метаболизма углеводов и липидов (рис. 1).

Рис. 1. Сводка опосредованных AdipoR сигнальных путей в клетках млекопитающих и опосредованных IZh3 сигнальных путей в S. cerevisiae клеток.

(A) Компоненты сигнального пути AdipoR1 клеток млекопитающих показаны черным шрифтом, а их гомологи S. cerevisiae , если они известны, показаны красным шрифтом. В клетках млекопитающих адаптерный белок, содержащий домен гомологии плекстрина, фосфотирозинсвязывающий домен и мотив 1 лейциновой молнии (APPL1), взаимодействует непосредственно с AdipoR1. Взаимодействие адипонектина (ADPN) с AdipoR1 стимулирует взаимодействие AdipoR1-APPL1. Это приводит к высвобождению Ca 2+ из ER в цитозоль, а также увеличивает экспорт киназы LKB1 из ядра.Приток внеклеточного Ca 2+ в цитозоль также стимулируется адипонектином, хотя механизм, с помощью которого это происходит, еще предстоит выяснить. Увеличение концентрации Ca 2+ в цитозоле активирует Ca 2+ / кальмодулин-зависимую протеинкиназу (CaMKK), которая, в свою очередь, активирует AMP-активированную протеинкиназу (AMPK) путем фосфорилирования ее α-субъединицы. Однако фосфорилирование α-субъединицы AMPK с помощью локализованной в цитозоле киназы LKB1 является основным путем активации AMPK.Взаимодействие адипонектин-AdipoR1 также увеличивает активность клеточной церамидазы, что, в свою очередь, приводит к фосфорилированию субъединицы AMPKα. Детали этого пути пока не ясны. Активация AMPK требуется для многих антидиабетических и антиатеросклеротических эффектов адипонектина. В эндотелиальных клетках сосудов взаимодействие AdipoR1 с адипонектином активирует протеинкиназу A (PKA), которая снижает накопление активных форм кислорода (ROS) и тем самым уменьшает воспаление.(B) Субъединичная структура S. cerevisiae AMPK (ScAMPK). Подобно AMPK млекопитающих, ScAMPK представляет собой тример, состоящий из субъединиц α, β и γ. Указаны гены, кодирующие изоформы субъединиц β, а также единственные субъединицы α и γ. (C) Компоненты сигнальных путей, опосредованных IZh3 , в S. cerevisiae показаны красным шрифтом. Взаимодействие IZh3 (гомолог AdipoRs) с осмотином (OSM) активирует PKA через путь RAS2-cAMP. Сверхэкспрессия ИЖ3 , сверхэкспрессия AdipoR1 , обработка S.cerevisiae , экспрессирующие AdipoR1 с адипонектином, и обработка клеток S. cerevisiae , экспрессирующих различные уровни IZh3 тауматином (THN, гомолог осмотина), как было показано, активируют PKA за счет увеличения клеточной активности церамидазы. Активация PKA приводит к снижению транскрипции из чувствительного к стрессу промоторного элемента ( STRE ) и увеличению содержания клеточных АФК. Активированная PKA способствует экспорту ScAMPK из ядра, что приводит к снижению транскрипции с промотора ферроксидазы (FET3 ).Активированная PKA также репрессирует FET3 транскрипцию через стресс-чувствительные факторы транскрипции MSN2 / 4. Мутационный анализ показывает, что гены, кодирующие белок APPL1-lke Sip3, LKB1-подобный белок Sak1, субъединицу β ScAMPK Sip1 и субъединицу γ ScAMPK Snf4, являются компонентами пути, ведущего от IZh3 (или AdipoR1 ) к FET3. репрессия в S. cerevisiae .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.g001

Во-вторых, хотя четыре белка S. cerevisiae Izh2p, Izh3p, Izh4p и Izh5p имеют предполагаемое сходство последовательностей с AdipoR млекопитающих, адипонектин неспособен стимулировать внутриклеточную передачу сигналов, которая приводит к репрессии ферроксидазы FET3 ), ген, участвующий в гомеостазе ионов металлов у дрожжей, если не экспрессируются AdipoR1 или AdipoR2 [26]. Эти результаты демонстрируют, что можно исследовать передачу сигналов от AdipoR1 и AdipoR2 отдельно в дрожжах.

В-третьих, активация PKA и регуляция экспрессии генов с помощью AMPK за счет взаимодействия адипонектин-AdipoR вносят вклад в благоприятные эффекты адипонектина в системах млекопитающих [3], [22], [24]. Передача сигналов от Izh3p и AdipoRs также, как было показано, активирует путь PKA и влияет на AMPK-зависимую экспрессию генов в S. cerevisiae (Рисунок 1). Izh3p и AdipoR негативно регулируют экспрессию генов, участвующих в гомеостазе ионов металлов, через PKA и AMPK в S.cerevisiae , через промоторный элемент CCCTC [26], [27]. Следует отметить, что активация PKA имеет противоположный эффект на содержание активных форм кислорода (АФК) в клетках в системах млекопитающих и дрожжей. Активация пути AdipoR-PKA снижает клеточное содержание АФК в эндотелиальных клетках сосудов млекопитающих [22]. С другой стороны, было показано, что активация пути IZh3-PKA подавляет транскрипцию из стресс-зависимого промоторного элементаCCCCT (STRE), который обнаруживается в некоторых генах, индуцируемых окислительным стрессом, что увеличивает клеточное содержание ROS в S .cerevisiae [27], [28], [29].

Однако адипонектин-AdipoR-зависимая активация AMPK посредством увеличения фосфорилирования S. cerevisiae AMPKα субъединицы Snf1p еще не описана. Поскольку это активирующее фосфорилирование играет ключевую роль в антидиабетическом действии адипонектина в скелетных мышцах и печени, а также в кардиозащитном действии адипонектина [3], [19], [22], это свидетельствует о центральном элементе адипонектина дрожжей. Сигнализация AdipoR отсутствует.Следовательно, мы намеревались создать системы S. cerevisiae , чтобы (а) точно сообщать о взаимодействиях агонист-AdipoR и (б) сообщать о зависимой от агониста-AdipoR активации сигнальных путей, подобных тем, которые, как известно, важны для контроля диабета или сердечно-сосудистой функции. у млекопитающих. Здесь мы сообщаем о расщепленном анализе на основе люциферазы светлячков для исследования взаимодействий лиганд-AdipoR1. Мы также показываем, что активация дрожжевой AMPK путем фосфорилирования ее α-субъединицы, Snf1p, может наблюдаться в ответ на взаимодействие агонист-AdipoR1 или агонист-AdipoR2 в S.cerevisiae и демонстрируют зависимое от агониста AdipoR подавление передачи сигналов окислительного стресса посредством активации пути PKA в S. cerevisiae . Сплит-люциферазные анализы могут быть легко адаптированы для многолуночных массивов, подходящих для высокопроизводительных платформ, с использованием автоматического посева реплик и механизированной промывки. Следовательно, наша система на основе S. cerevisiae обещает стать эффективным инструментом для идентификации новых фармацевтически активных агонистов AdipoR.Это также облегчит изучение структуры-функции AdipoR и анализ влияния структуры лиганда на взаимодействия лиганд-AdipoR, которые могут служить основой для интеллектуального синтеза агонистов.

Материалы и методы

Штаммы и питательные среды

Штаммы S. cerevisiae были производными BWG1-7a MATa ade1-100 ura3-52 leu2-3,112 his4-519 GAL + [30] или BY4741 ( MATa his3 Δ 1 leu2 Δ 0 met5 Δ 0 ura3 Δ 0 ) (от Dr.Д. Рамотар, Монреальский университет). Дрожжевые клетки выращивали при 30 ° C либо в YPD (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% декстрозы), либо в селективной синтетической полной среде [0,67% азотистого основания дрожжей без аминокислот, 2% декстрозы, pH 5,7, с добавлением соответствующих смесь для отсева (Клонтех, Маунтин-Вью, Калифорния, США)]. Для контроля экспрессии гена под промотором GAL декстрозу заменяли раффинозой и / или галактозой до конечной концентрации 2%. Дрожжевые клетки трансформировали ацетатом лития [31].Нацеленные инсерционные или делеционные мутации IZh3 , SNF1 и SIP3 были сделаны с использованием гена Kan MX4, как описано [32] и подтверждены с помощью ПЦР.

Конструирование плазмид

Конструирование плазмиды pSTRE- lacZ ( LEU2 ) было описано ранее [29]. Полные кодирующие области рецепторов адипонектина человека AdipoR1 и AdipoR2 и адаптерного белка, содержащие домен гомологии плекстрина, домен связывания фосфотирозина и мотив 1 лейциновой молнии (APPL1), получали с помощью ОТ-ПЦР из общей РНК, выделенной из клеток рака молочной железы MCF-7.Последовательности праймеров, используемых в конструкциях, описанных ниже, показаны в таблице S1. Продукты ПЦР, полученные с использованием пар праймеров AdipoR1-F-Spe1 / AdipoR1-R-Cla1 и AdipoR2-F-Spe1 / AdipoR2-R-Cla1, вставляли в промежуточный вектор путем клонирования TA, затем вырезали с помощью SpeI и ClaI и вставляли в соответствующие сайты p426-GPD для конструирования плазмид p426-GPD-AdipoR1 и p426-GPD-AdipoR2. Кодирующую последовательность APPL1 амплифицировали с использованием праймеров APPL1-F-KpnI-SpeI и APPL1-R-SalI-1.Продукт ПЦР разрезали с помощью KpnI и SalI и вставляли между соответствующими сайтами в векторе 35S-NLuc [33], получая химерную конструкцию 35S-APPL1-NLuc. Затем фрагмент APPL1-NLuc вырезали путем переваривания SpeI и PstI и лигировали в разрезанный p425-GPD с помощью тех же ферментов, чтобы получить конструкцию p425-GPD-APPL1-NLuc. Конструирование pESC-CLuc-AdipoR1 и pESC-CLuc-AdipoR2 также выполняли в два этапа. Сначала CLuc был введен ниже промотора GAL1 в pESC-URA, а затем AdipoR1 или AdipoR2 были слиты в рамке считывания с CLuc.CLuc амплифицировали с помощью ПЦР из вектора 35S-CLuc с использованием праймеров CLuc-F-BamHI и CLuc-R-XhoI-AscI-HindIII. Продукты ПЦР расщепляли BamHI и HindIII и клонировали в родственные сайты pESC-URA, получая pESC-CLuc. Затем кодирующую последовательность AdipoR1 и AdipoR2 амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР из общей РНК с использованием пар праймеров AdipoR1-F-XhoI / AdipoR1-HindIII и AdipoR2-F-XhoI / AdipoR2-HindIII соответственно. Продукты ПЦР расщепляли XhoI и HindIII и лигировали в pESC-CLuc, расщепленную теми же ферментами, с получением pESC-CLuc-AdipoR1 и pESC-CLuc-AdipoR2.pESC-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc, который содержит GAL1- CLuc-AdipoR1 и GAL10, -APPL1-NLuc в одном и том же векторе, был сконструирован следующим образом. APPL1-NLuc амплифицировали из p425-GPD-APPL1-NLuc с помощью ПЦР с использованием пары праймеров APPL1-F-NotI / NLuc -R-ClaI. Продукт ПЦР переваривали NotI и ClaI, вставленными в родственные сайты pESC-CLuc-AdipoR1, получая pESC-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc. Все конструкции были проверены секвенированием.

Плазмиды pYES-EGFP-AdipoR1 и pYES-EGFP-AdipoR2, которые содержали EGFP, слитый в рамке считывания с N-концом AdipoR1 и AdipoR2, соответственно, были сконструированы следующим образом.Полные ORF AdipoR1 и AdipoR2 амплифицировали с помощью ПЦР из кДНК, выделенной из клеток THP-1 человека, с использованием пар праймеров AdipoR1-F-GFP / AdipoR1-R-GFP и AdipoR2-F-GFP / AdipoR2-R-GFP, показанных в таблице S1. . Вектор pYES-EGFP (расщепленный BamHI и XhoI), смешанный с подходящим продуктом ПЦР (расщепленный EcoR1 и Xho1), трансформировали в штамм BY4741 S. cerevisiae для клонирования с восстановлением разрывов. Положительные клоны были подтверждены секвенированием.

Осмотин, адипонектин и пептиды

Осмотин очищали до гомогенности из культивированных в суспензии адаптированных к соли клеток табака, как описано ранее [34].Осмотин хранили в виде стерильного раствора в сверхчистой воде (степень чистоты для ВЭЖХ). Препарат осмотина был определен как гомогенный более 99% с помощью 2D-электрофореза в полиакриламидном геле и масс-спектрометрии. IC 50 (количество осмотина, снижающее рост на 50%) был определен литературными методами [35] и находился в диапазоне 4–8 мкг / мл для партий осмотина, использованных в этом исследовании. Осмотин и адипонектин количественно определяли с использованием реагента BCA Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL, USA), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.Если не указано иное, чистый рекомбинантный Escherichia coli экспрессировал N-концевой (His) 6 -меченый полноразмерный адипонектин человека, использованный в этих исследованиях, был подарком д-ра А. Шархуу (КАУСТ, Саудовская Аравия) или д-ра I. Сокольчик (Университет Пердью, США). Биологическая активность партий полноразмерного адипонектина человека без эндотоксина, используемых в этой работе, была подтверждена путем измерения его способности индуцировать апоптоз клеток рака молочной железы MCF-7 или клеток моноцитарного лейкоза THP-1 [36], [37].Бактериально экспрессируемый глобулярный адипонектин человека (Biovendor, Кандлер, Северная Каролина, США) и бактериально экспрессируемый рекомбинантный полноразмерный адипонектин человека (Biovision, Mountain View, Калифорния, США или Genway, Сан-Диего, Калифорния, США) использовали в некоторых тестах, как указано в цифры. Используемые в этой работе синтетические циклические пептиды OSMpep и ZMTNpep были приобретены у American Peptide Company (Саннивейл, Калифорния, США). Чистота пептидов составляла 98%, и их растворяли в воде при концентрации 1 мг / мл.

Анализ экспрессии гена с помощью ОТ-ПЦР

Тотальную РНК получали с использованием набора для экстракции RiboPure-Yeast (Ambion, Grand Island, NY, USA) из 3 мл ночной культуры, выращенной в селективной минимальной среде, и загрязнение геномной ДНК было устранено с помощью набора TURBO DNA-free (Ambion).кДНК синтезировали из общей РНК (2 мкг) с использованием обратной транскриптазы M-MLV (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Праймеры ПЦР, используемые для амплификации целевых генов, перечислены в таблице S2. Программа ПЦР составляла 2 минуты при 95 ° C с последующими 25 циклами по 1 мин денатурации при 94 ° C, 2 мин отжига при температуре, специфичной для каждого фрагмента гена (, например, 54 ° C для фрагмента ACT1, ) и 4 мин удлинения при 72 ° C. Затем следовало удлинение при 72 ° C в течение 7 минут. Продукты ПЦР анализировали на 1% агарозном геле.

Люминесцентная визуализация и измерение активности люциферазы

Культуры выращивали в течение ночи при 30 ° C в селективном минимуме с 2% рафинозы в качестве источника углерода. Клетки собирали центрифугированием в течение 5 минут при 6000 об / мин, и осадок клеток промывали той же средой, но без сахара. Клетки ресуспендировали при A 600 нм 0,4 в селективной минимальной среде с добавлением галактозы или смеси галактоза-раффиноза (2% сахара) в качестве источника углерода и выращивали при 30 ° C в течение 16 часов.Культуры доводили до 0,4 A 600 нм и аликвоты (100 мкл) центрифугировали в течение 1 мин при 16000 × g. Осадки клеток ресуспендировали в 100 мкл 0,1 М Na-цитратного буфера pH 3,0, содержащего 1 мМ D-люциферин (Gold Biotechnology, Сент-Луис, Миссури, США), и переносили в отдельные лунки 96-луночного планшета (полистирол Nunc White). . Планшет для анализа инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре в темноте перед визуализацией люминесценции под камерой CCD (Lumazone, Princeton Instruments, США) или для измерения активности люциферазы с использованием ридера для микропланшетов TECAN Ultra 96.Единицу активности люциферазы рассчитывали как значение люминесценции образца минус значение люминесценции холостого растворителя.

Измерение активности β-галактозидазы

Для определения активности β-галактозидазы клетки выращивали в селективной минимальной среде до A 600 нм 0,4, ресуспендировали в YPD при A 600 нм 6,0 (примерно 10 8 клеток / мл). Затем клетки (1 мл) смешивали с водой (0,2 мл), содержащей различные количества осмотина, и инкубировали при 30 ° C с периодическим перемешиванием.Клетки собирали в конце инкубационного периода центрифугированием и ресуспендировали в том же объеме ледяного Z-буфера (60 мМ Na 2 HPO 4 , 40 мМ NaH 2 PO 4 , 10 мМ KCl, 1 мМ MgSO 4 , 50 мМ 2-меркаптоэтанол, pH 7,0). Измеряли A 600 нм суспензии клеток и доводили до 1,0 путем добавления большего количества ледяного Z-буфера. Клетки (0,1 мл) смешивали с Z-буфером (0,9 мл), хлороформом (0,1 мл) и 0,1% SDS (5 мкл), встряхивали в течение 10 секунд, а затем подвергали трем циклам замораживания-оттаивания (жидкий азот 30 секунд – 37 ° C). C 90 сек).Суспензию разрушенных клеток нагревали до 28 ° C и инициировали ферментативную активность добавлением -нитрофенил-β-D-галактопиранозида (0,2 мл раствора 4 мг / мл). Реакции давали возможность протекать при 28 ° C в течение различных периодов времени, а затем останавливали добавлением 1 М раствора карбоната натрия (0,5 мл). Суспензию осветляли центрифугированием и измеряли оптическую плотность супернатанта при 420 нм. Одна единица активности β-галактозидазы была определена как 1000 X (ΔA 420 нм / мин / A 600 нм ).

Иммуноблот-анализ

Для исследования экспрессии AdipoR, меченных EGFP, культуры выращивали, как описано в разделе «Визуализация люминесценции и измерение активности люциферазы». Экстракты общего белка получали из клеток, выращенных на 2% галактозе в буфере для дрожжевой экстракции (50 мМ трис-HCl pH 8,0, 50 мМ NaCl, 5% глицерин, по 1 мМ EDTA, фенилметилсульфонилфторид и дитиотеритол, 0,5 мкг / мл каждый пепстатина, апротинина и лейпептина), как описано ранее [38].Сто мкг мембранных белков фракционировали с помощью 10% SDS-PAGE и переносили на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) (Immobilon P; Millipore). EGFP визуализировали методом ECL (GE Healthcare, UK) с использованием моноклональных антител к GFP в качестве первичных антител (Clontech, Mountain View, CA, USA) и вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена.

Для исследования фосфорилирования субъединицы S. cerevisiae AMPKα (Snf1p) клетки выращивали и обрабатывали осмотином (или адипонектином) точно так, как описано в разделе «Измерение активности β-галактозидазы».Обработанные клетки разрушали методом экстракции белка трихлоруксусной кислотой (TCA), а экстракты, не содержащие клеток, фракционировали с помощью SDS-PAGE на 10% полиакриламидных гелях. После переноса на нитроцеллюлозные мембраны (Millipore, Billerica, MA, USA) фосфо-Snf1p был обнаружен методом ECL (Thermo, Rockford, IL, USA) с использованием моноклональных антител к фосфо-AMPKα (Thr172) в качестве первичного антитела (Cell Signaling). , Danvers, MA, USA) и козьей антикроличьей пероксидазой хрена в качестве вторичных антител. Интенсивность полос измеряли на люминесцентном анализаторе изображений LAS-4000 с Multi Gauge V3.0 программа (Fuji film, Токио, Япония). Для определения чувствительности к осмотину клетки промывали трижды YPD в конце периода инкубации, и серийные разведения в воде наносили пятнами на чашки с агаром YPD.

Конфокальная микроскопия

Клетки, экспрессирующие рецепторы, меченные EGFP, выращивали, как описано в разделе «Визуализация люминесценции и измерение активности люциферазы». Клетки, выращенные в 2% -ной галактозе, фиксировали инкубацией в 0,1% -ном формальдегиде при комнатной температуре в течение 25 мин.После трехкратной промывки 0,1 М натрий-фосфатным буфером, содержащим 0,137 М NaCl (pH 6,5), клетки ресуспендировали в том же буфере и окрашивали в течение 5 минут DAPI (0,5 мкг / мл) в темноте при комнатной температуре. Клетки исследовали и фотографировали под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом (Zeiss LSM 510 META).

Вычислительные исследования

Подробная информация о гомологическом моделировании, МД-моделировании и исследованиях стыковки приведена в Методах S1. Вкратце, модель 3D-гомологии человеческого AdipoR1 была построена для аминокислот 135–364 с помощью пакета Schrödinger Suite 2011 с использованием архейного ( Natronomonos pharaonis ) белка фототаксиса родопсина II (PDB id: 1GU8) в качестве структуры матрицы [39].Полученная модель гомологии AdipoR1 была встроена в мембрану 1,2-дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC) и подвергнута минимизации и МД-релаксации [программный пакет GROMACS 4.5.5 и силовое поле GROMOS53a6 [40]. Трехмерная структура глобулярного домена адипонектина человека (остатки 105–254) была построена с использованием пакета молекулярного моделирования структуры YASARA [41] с использованием мышиной изоформы (PDB id: 1C3H) в качестве матрицы [42]. Минимизация энергии и МД релаксация выполнялись с использованием скриптов Yasara. Для стыковки белков и комплексов пептид / AdipoR1 использовались PATCHDOCK и FireDock.Полученные комплексы были минимизированы по энергии и проанализированы после МД моделирования (GROMACS).

Результаты

Рецепторы адипонектина экспрессируются на поверхности дрожжевых клеток

Мы впервые подтвердили правильную локализацию AdipoR в плазматических мембранах S. cerevisiae с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием слитых белков EGFP-AdipoR. Как показано на фиг. 2, клетки штамма BY4741 S. cerevisiae дикого типа , трансформированные многокопийной плазмидой, экспрессирующей EGFP под промотором GAL , проявляли диффузную внутриклеточную флуоресценцию, указывающую на цитоплазматическую локализацию.Однако клетки, экспрессирующие EGFP-AdipoR1 или EGFP-AdipoR2 из одного и того же плазмидного вектора, проявляли сильную флуоресценцию на поверхности, которая отсутствовала в контрольных клетках, экспрессирующих только EGFP, что свидетельствует о локализации рекомбинантных AdipoR на плазматической мембране. Флуоресценция также наблюдалась в везикулах, которые напоминали пре-вакуолярный компартмент, возможно, из-за деградации AdipoR1 и AdipoR2 в вакуоли. Экспрессию EGFP-AdipoR1 (65 кДа), EGFP-AdipoR2 (65 кДа) и EGFP (26 кДа) подтверждали вестерн-блот-анализом бесклеточных экстрактов с антителом против GFP.

Фигура 2. AdipoRs экспрессируются на плазматической мембране S. cerevisiae .

(A) Субклеточная локализация AdipoR с помощью конфокальной микроскопии. S. cerevisiae штамм BY4741, несущий плазмиду pYES-EGFP (GFP), pYES-EGFP-AdipoR1 (GFP-AdipoR1) и pYES-EGFP-AdipoR2 (GFP-AdipoR2), культивировали в селективной минимальной среде, содержащей 2% галактозы. Показаны изображения клеток, которые находились в ранней логарифмической фазе роста. (B) Вестерн-блоттинг всех экстрактов мембранных белков, которые фракционировали с помощью 10% SDS-PAGE.Прогнозируемые молекулярные массы GFP-AdipoR1 и GFP-AdipoR2 составляют около 65 кДа.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.g002

Стратегия отчетности о взаимодействии адипонектин-AdipoR1

В клетках млекопитающих APPL1 напрямую взаимодействует с внутриклеточной N-концевой последовательностью AdipoR1 [43], [44]. Взаимодействие AdipoR1-APPL1 стимулируется адипонектином и запускает активацию AMPK в клетках млекопитающих (рис. 1). APPL1 также взаимодействует с AdipoR2 [43], но нижестоящая передача сигналов, возникающая в результате взаимодействия AdipoR2-APPL1, не совсем понятна.Поскольку стимулированное лигандом взаимодействие AdipoR1-APPL1 является самой ранней известной стадией в сигнальном каскаде адипонектин-AdipoR, мы решили использовать его в качестве основы для нашего анализа на основе S. cerevisiae-, нацеленного на взаимодействия AdipoR1-лиганд. В качестве репортерной системы для контактов AdipoR1-APPL1 мы выбрали сплит-люциферазный бимолекулярный анализ комплементации, так как это хорошо зарекомендовавший себя метод изучения белок-белковых взаимодействий в клетках млекопитающих, растений и S. cerevisiae [45], [46] , [47].Соответственно, химерный ген, кодирующий APPL1 человека, слитый в рамке считывания на своем С-конце с фрагментом люциферазы светлячка 2-416 (NLuc), был клонирован в сайт множественного клонирования 1 вектора pESC-URA с получением контрольной плазмиды pESC-URA- APPL1-NLuc (рис. 3А). Эта плазмида обеспечивает экспрессию APPL1-NLuc с промотора GAL10 . Точно так же второй химерный ген, кодирующий фрагмент 398-550 люциферазы светлячка (CLuc), слитый с N-концом AdipoR1 и вставленный в сайт множественного клонирования 2 вектора pESC-URA, давал контрольную плазмиду pESC-URA-CLuc- AdipoR1 (рис. 3А).Эта плазмида обеспечивает экспрессию CLuc-AdipoR1 с промотора GAL1 . Оба химерных белка, CLuc-AdipoR1 и APPL1-NLuc, содержали линкер между двумя фрагментами, чтобы придавать некоторую подвижность доменам люциферазы, облегчая восстановление активности люциферазы. Затем из этих двух контрольных плазмид с использованием клонирования с восстановлением пробелов была сконструирована тестовая плазмида pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc для одновременной экспрессии обоих химерных белков, APPL1-NLuc и CLuc-AdipoR1.Все плазмиды трансформировали в штамм BY4741 S. cerevisiae для теста экспрессии.

Рисунок 3. Анализ комплементационных колоний люциферазы светлячков для взаимодействия AdipoR1 и APPL1.

(A) Схематическое изображение конструкций плазмидного вектора. CLuc-AdipoR1 был клонирован в сайт множественного клонирования 2 (MCS2, зеленая тень) pESC-URA для экспрессии с промотора GAL1 , а Appl1-NLuc был клонирован в MCS1 (оранжевая тень) pESC-URA для экспрессии из Промотор GAL10 .pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc (не показан) содержит изображенную конструкцию APPL1-NLuc, вставленную между сайтами Not1 и Sac1 MCS1 pESC-URA-CLuc-AdipoR1. (B) Визуализация взаимодействия AdipoR1-APPL1 в колониях. Клетки штамма BY4741, нетрансформированные (без плазмиды) или трансформированные указанными плазмидами, разводили на минимальной среде без урацила, содержащей 2% галактозы. После 2 дней инкубации при 30 ° C планшеты фотографировали до (-) и отображали после (+) опрыскивания D-люциферином.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.g003

Proof-of-Concept: зависимое от рецепторного уровня восстановление люциферазной активности

Сообщалось, что сверхэкспрессия IZh3 и AdipoR1 может активировать нижестоящую передачу сигналов, приводя к подавлению зависимой от промотора FET3 транскрипции даже в отсутствие лиганда (Рисунок 1) [26], [48]. Таким образом, чтобы доказать, что двухмолекулярный анализ комплементации, основанный на сплит-люциферазе, был функциональным, мы выполнили люминесцентную визуализацию колоний после полной индукции промоторов GAL1 и GAL10 2% галактозой в среде для выращивания.Можно видеть (рис. 3B), что при нанесении субстрата, D-люциферина, только трансформанты, несущие тестовую плазмиду pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc, проявляли люминесценцию, тогда как трансформанты, несущие вектор pESC-URA или контрольные плазмиды pESC-URA-CLuc-AdipoR1 и pESC-URA-APPL1-NLuc этого не сделали. Затем мы изучили, пропорциональна ли полученная активность репортерного гена уровням экспрессии AdipoR1 и APPL1 . Во-первых, было подтверждено, что уровни экспрессии AdipoR1 и APPL1 в трансформанте pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc увеличиваются пропорционально концентрации галактозы в среде для выращивания (фиг. 4A).Затем анализы, проведенные в микротитровальных планшетах, показали, что активность люциферазы в трансформантах pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc увеличивалась в зависимости от концентрации галактозы в среде (рис. 4В). Опять же, не удалось обнаружить значительную активность люциферазы в контроле, который экспрессировал только одного или ни одного из партнеров по взаимодействию (рис. 4B). Эти результаты показали, что активность репортера напрямую коррелирует с количеством взаимодействующих партнеров.

Рисунок 4. Репортерная активность люциферазы зависит от уровня экспрессии AdipoR1 и APPL1.

(A) Анализ RT-PCR экспрессии AdipoR1 и APPL1 в общей РНК (2 мкг) из клеток штамма BY4741, несущих pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc, которые выращивали в течение 16 часов при 30 ° C. ° C в селективной минимальной среде при указанных концентрациях галактозы. Конечную концентрацию сахаров в питательной среде доводили до 2% рафинозой. Выражение ACT1 показано для нормализации. (B) Количественная оценка активности люциферазы в клетках BY4741, несущих плазмиды pESC-URA, pESC-URA-CLuc-AdipoR1, pESC-URA-APPL1-NLuc и pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc.Клетки выращивали в течение 16 ч при 30 ° C в селективной минимальной среде при указанных концентрациях галактозы. Измерения активности люциферазы проводили, как описано в разделе «Методы». (C) Визуализация (вверху) и количественная оценка активности люциферазы (внизу) в трансформантах pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc штамма BY4741 (родительский) или его изогенных производных штаммов izh3Δ и sip3Δ . Анализы проводили, как описано выше, на клетках, которые выращивали в течение 16 ч при 30 ° C в селективной минимальной среде при указанных концентрациях галактозы.Результаты выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение от трех отдельных экспериментов с тремя образцами. Значительное отличие от родительского штамма обозначено звездочками. Обозначения: **, p <0,01; ***, р <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.g004

Среди белков семейства IZH, Izh3p имеет наибольшую гомологию с AdipoR (идентичность аминокислотных последовательностей примерно 32%). Поэтому мы исследовали, может ли IZh3 вмешиваться во взаимодействие AdipoR1-APPL1, приводящее к снижению репортерной активности люциферазы.Как показано на Фигуре 4С, активность люциферазы значительно увеличивалась при инактивации ИЖ3 . Этот эффект наблюдался в клетках, выращенных в 1%, 1,5% и 2% галактозе, указывая на то, что Izh3p конкурирует с AdipoR1 за связывание с APPL1. Предполагаемый ортолог APPL1 в S. cerevisiae — это Sip3p, и генетические данные подтверждают роль SIP3 в передаче сигналов IZh3 (Figure 1) [26]. Однако инактивация SIP3 существенно не увеличивала активность люциферазы, указывая на то, что Sip3p не конкурирует с APPL1 за связывание AdipoR1 (фиг. 4C).

Демонстрация увеличения активности люциферазы, индуцированного адипонектином и осмотином

Затем мы проверили, стимулирует ли инкубация индуцированных галактозой клеток с лигандами AdipoR1 активность репортера люциферазы. Помимо адипонектина в качестве тестового лиганда мы также использовали осмотин. Осмотин — это защитный белок табака, который, как было показано, является структурным и функциональным гомологом адипонектина [29]. В частности, осмотин стимулирует фосфорилирование AMPKα AdipoR-зависимым образом в клетках скелетных мышц мышей, а также стимулирует IZh3 -зависимую внутриклеточную передачу сигналов в S.cerevisiae [29]. В то время как прямое связывание адипонектина и осмотина с AdipoRs еще не наблюдалось экспериментально, результаты стыковки на основе гомологической модели подтверждают, что комплексы обоих белков с внеклеточной поверхностью AdipoR1 являются энергетически выгодными [49].

Люциферазная активность индуцированных галактозой клеток, несущих pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc штамма BY4741, увеличивалась при дополнительной инкубации либо с глобулярным адипонектином, либо с адипонектином полной длины из двух источников, либо с осмотином, по сравнению с инкубацией с растворителем (1 / 8 X PBS) (Рисунки 5A и S1).С другой стороны, активность люциферазы оставалась постоянной при дополнительной инкубации с белком отрицательного контроля альбумина бычьей сыворотки (БСА) по сравнению с инкубацией с растворителем (рис. 5А), что указывает на то, что активность люциферазы специфически стимулировалась предсказанными лигандами AdipoR1 [49 ]. Эти результаты также согласуются с экспериментами, показывающими, что передача сигналов AdipoR1 инициируется бактериально экспрессируемым адипонектином полной длины, глобулярным адипонектином и осмотином [21], [29]. Индуцированное лигандом увеличение активности люциферазы наблюдалось только при достижении детектируемого сигнала даже в отсутствие добавленного лиганда, что требовало, чтобы клетки были индуцированы 1-2% галактозой (Рисунки 5A и S1).Затем мы количественно оценили активность люциферазы в клетках, индуцированных различными концентрациями галактозы после инкубации с диапазоном концентраций осмотина (рис. 5B). Результаты подтвердили, что лиганд-индуцированная активность люциферазы наблюдалась только в клетках, которые росли с содержанием галактозы 1% или выше. Активность люциферазы была примерно одинаковой для 1% и 1,5% галактозы, а также не изменялась в диапазоне тестируемых концентраций осмотина (3,2–12,8 мкМ).

Рисунок 5. Лиганды AdipoR1, адипонектин и осмотин, вызывают повышение активности репортера Luc.

Клетки штамма BY4741, несущие pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc, выращивали в течение 16 часов при 30 ° C в селективной минимальной среде при указанных концентрациях галактозы, обрабатывали в течение 4 часов при 30 ° C указанными тестируемыми соединениями и затем анализировали на активность Luc. (A) Визуализация активности Люка. (B) Количественное измерение активности Luc как функции концентрации осмотина. Репрезентативное изображение относительной активности Luc при различных концентрациях осмотина показано для каждой концентрации галактозы.Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение для трех экспериментов с тремя образцами. Для каждой концентрации галактозы значимые различия по t-критерию Стьюдента между образцами, обработанными осмотином, и необработанными контрольными образцами указаны звездочками. Обозначения: PBS, 1/8 X PBS; f-ADPN, бактериально экспрессируемый адипонектин полной длины; BSA, бычий сывороточный альбумин, OSM, осмотин; g-ADPN, глобулярный адипонектин, экспрессируемый бактериями; **, p <0,01; ***, р <0,001.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0065454.g005

Оценка пептидов на основе тауматиноподобного белка (TLP) в качестве лигандов AdipoR1

Циклический производный осмотина пептид с девятью остатками (OSMpep, таблица 1), как было предсказано, взаимодействует с AdipoR1 на основе исследований молекулярного моделирования, а затем показано, что он индуцирует AdipoR1-зависимую внутриклеточную передачу сигналов в клетках млекопитающих [49]. Этот пептид является структурно стабильным и жестким, и моделирование его взаимодействия с AdipoR1 предсказало, что он связывается с той же областью AdipoR1, что и адипонектин [49].Белки с последовательностью, структурой и серологическим сходством с осмотином встречаются в растениях повсеместно и называются тауматин-подобными белками (TLP). Мы предположили, что гомологи OSMpep из других TLP, таких как соевый P21, банановый TLP, тауматин, Act d2 киви и кукурузный зеаматин, могут связываться с AdipoR1 так же или лучше, чем OSMpep. Эти TLP были выбраны в качестве источника пептидных последовательностей по следующим причинам: (i) структуры осмотина, бананового TLP, тауматина и зеаматина были определены с помощью рентгеновской кристаллографии (таблица 1), поэтому многие из выбранных пептидов подтверждено, что они существуют в аналогичном структурном контексте во всех TLP; (ii) тауматин и осмотин стимулируют IZh3 -зависимую передачу сигналов в S.cerevisiae и многие TLP обладают противогрибковой активностью, что делает возможным то, что некоторые из этих пептидов могут обладать биологической активностью [29], [48], [50], [51]. Мы проверили нашу гипотезу, используя подход молекулярного моделирования. Опираясь на стратегию Miele et al ., [49], мы смогли создать встроенную в мембрану модель гомологии AdipoR1, охватывающую аминокислоты 135–364 человеческого AdipoR1. 11 дополнительных C-концевых аминокислот в нашей модели по сравнению с таковой Miele et al ., [49] предоставили расширенную трансмембранную спираль 7 th , которая доходила до сайта связывания рецептора. Эта модель гомологии служила основой для стыковочных исследований адипонектина и осмотина с AdipoR1 и для прогнозирования взаимодействий пептид TLP-AdipoR1 и возможного связывания TLP (фигуры S2 и S3). Вскоре после того, как мы закончили наши исследования молекулярного моделирования, была опубликована кристаллическая структура сконструированного одноцепочечного тримерного глобулярного домена адипонектина человека (PBD id: 4DOU) [58]. Структура прекрасно согласуется с нашей моделью гомологии глобулярного адипонектина человека с почти идентичной геометрией остатков сайта связывания (рисунок S3G).Наша модель гомологии и сконструированные тримерные шаблоны [52] приводят к почти идентичным результатам стыковки.

Все взаимодействия лиганд / AdipoR1, предсказанные нашей моделью, имели место в одном и том же общем сайте связывания, который был образован центральной щелью между 3 внеклеточными петлями и простирался до С-конца 7 th трансмембранной спирали AdipoR1. Наша встроенная в мембрану модель дала четкие указания, идентифицирующие остатки AdipoR1, которые могут участвовать в связывании. Например, один из самых высоко оцениваемых комплексов для стыковки осмотина с моделью безмембранного рецептора [49] был опущен в нашей модели, встроенной в мембрану, потому что часть взаимодействия происходила на покрытой мембраной поверхности AdipoR1.Хотя наша встроенная в мембрану модель и модель безмембранного рецептора [49] предсказывают сходную общую архитектуру комплексов и сайтов связывания, мы обнаружили четкие различия в остатках, участвующих во взаимодействиях лиганд / AdipoR1 (подробности см. На рисунках S4 и S5). По сравнению с более ранней моделью [49], взаимодействующая область AdipoR1 в нашей модели обычно была короче на петле 1, смещена к С-концу петли 3 и расширена на петле 5. Мы также обнаружили слабое С-концевое взаимодействие. . Однако аминокислоты G354 и V355 AdipoR1, которые, как предполагается, являются взаимодействующими остатками в модели Miele et al., и др. ., [49] оказались встроенными в мембрану и, следовательно, недоступны в нашей модели. В целом, удлинение спирали 7 и встраивание в мембрану привело к важным различиям в предсказании сайтов связывания лиганда на AdipoR1.

Оценки стыковки, полученные для тестируемых пептидов TLP, предполагают, что пептид, производный от осмотина (OSMpep), имеет наивысшее сродство связывания с AdipoR1, в то время как пептид, производный от зеаматина (ZMTNpep), является самым слабым связывающим лигандом (Таблица 1). Однако OSMpep и ZMTNpep очень похожим образом взаимодействуют с сайтом связывания AdipoR1, который также сильно напоминает взаимодействие AdipoR1-осмотин (Рисунки 6, S3D, S4 и S6).Мы проверили предсказание модели экспериментально, используя анализ расщепленной люциферазы, описанный выше. Анализ проводили на мутанте izh3Δ , чтобы избежать возможного вмешательства со стороны Izhp. Как показано на фиг. 6D, интенсивность люминесценции клеток, трансформированных pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc, обработанных осмотином или OSMpep, была значительно выше, чем у клеток, обработанных PBS или эквивалентной концентрацией ZMTNpep. Таким образом, расчетные предсказания и экспериментальные результаты согласуются, что свидетельствует о том, что анализ расщепленной люциферазы способен различать хорошие и плохие лиганды AdipoR1.

Фиг. 6. Сравнение связывания пептидных лигандов, происходящих из TLP, с AdipoR1.

3D-модель (A) OSMpep и (B) ZMTNpep, связанных с AdipoR1. Пептиды показаны в виде шариков и палочек (атомы C показаны зеленым цветом). Взаимодействующие остатки AdipoR1 показаны только в виде стержней (взаимодействующие остатки: C серым цветом; невзаимодействующие остатки: C фиолетовым цветом). Цветовая кодировка атомов: белый = H, красный = O, синий = N, желтый = S. (C) Наложение осмотина (красный) и трех самых высоко оцененных поз OSMpep (пептидные нити зеленого, фиолетового и оранжевого цвета иллюстрируют ориентацию поз с 1 st , 2 nd и 3 rd наивысший балл стыковки), привязанных к AdipoR1 (синий).(D) Проверка силы взаимодействия пептидов с AdipoR1 с помощью анализа расщепленной люциферазы. Клетки штамма BY4741, несущие pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc, выращивали в течение 16 часов при 30 ° C в селективной минимальной среде, содержащей 1,5% галактозы, обрабатывали в течение 4 часов при 30 ° C указанными тестируемыми соединениями и затем использовали для измерение активности люциферазы. Концентрации тестируемых соединений в анализе были: PBS, 1/8 X PBS; ZMTNpep, 80 мкг / мл; осмотин, 80 мкг / мл (3,1 мкМ) и OSMpep, 80 мкг / мл. Показано типичное изображение активности люциферазы и количественной оценки люминесценции под камерой CCD.Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение от трех отдельных экспериментов с тремя образцами. Звездочки представляют значимые различия при **, p <0,01 по t-критерию Стьюдента.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.g006

Передача сигналов осмотина, опосредованная рецепторами адипонектина, приводит к фосфорилированию Snf1p

AMPK имеют консервативную структуру и необходимы для контроля энергетического метаболизма у дрожжей, растений и млекопитающих [24], [25]. Каталитическая активность AMPK повышается за счет фосфорилирования консервативного остатка Thr на каталитической α-субъединице.Фосфорилирование субъединицы AMPKα мыши на этом консервативном Thr 172 адипонектином или осмотином отменяется путем подавления экспрессии рецепторов адипонектина в культивируемых мышиных мышечных трубках [29]. Snf1p является единственной субъединицей AMPKα, присутствующей в протеоме S. cerevisiae , и он активируется фосфорилированием консервативного треонина, Thr 210 , в ответ на глюкозное голодание или стресс [25]. Чтобы проверить, могут ли осмотин и адипонектин стимулировать AdipoR1- или AdipoR2-зависимое фосфорилирование Snf1p по Thr 210 , мы определили клеточное содержание фосфо-Snf1p в обработанных осмотином или адипонектином клетках штамма BWG1-7a, которые экспрессировали1 AdipoR1 AdipoR1. или AdipoR2 конститутивно из мультикопийной плазмиды (фигура S7).Не наблюдалось значительного увеличения уровней фосфо-Snf1p в трансформантах с пустым вектором, pAdipoR1 или pAdipoR2 после обработки осмотином или адипонектином. Это указывает на то, что IZh3 может мешать AdipoR1-зависимой передаче сигналов активации Snf1 точно так же, как он мешает APPL1-зависимой передаче сигналов AdipoR1 (Figure 4C). Поэтому мы повторили этот эксперимент с мутантом izh3Δ штамма BWG1-7a. Мы обнаружили, что на клеточное содержание Thr 210 -фосфорилированного Snf1p не влияет обработка осмотином или адипонектином в мутанте izh3 , трансформированном пустым вектором (фиг. 7).Конститутивная экспрессия AdipoR1 или AdipoR2 из одного и того же мультикопийного вектора приводила к зависящему от времени и концентрации увеличению фосфорилирования Snf1p по Thr 210 в ответ на лечение осмотином или адипонектином (Фигуры 7 и S8). Эти результаты продемонстрировали, что передача сигналов AdipoR1 и AdipoR2 в клетках дрожжей и млекопитающих имеет важный общий элемент, а именно активацию AMPKα путем фосфорилирования. Они также показали, что IZh3 препятствует передаче сигналов AdipoR, что приводит к активации Snf1p в S.cerevisiae .

Рисунок 7. Передача сигналов осмотина, опосредованная рецепторами адипонектина, индуцирует фосфорилирование Snf1p в мутанте izh3Δ .

(A) Лизаты клеток (100 мкг белка) штамма BWG1-7a и изогенной линии Δsnf1 :: Kan_MX фракционировали с помощью 10% SDS-PAGE. Показаны блоты, зондированные антителом против фосфо-AMPK (Thr-172). Ожидаемый размер Snf1p составляет 72 кДа. (B, C) Клетки (около 10 8 / мл) штамма BWG1-7a Δizh3 :: Kan_MX , трансформированные p426GPD (Vec), p426GPD- AdipoR1 (pAdipoR1) или p426GPD- AdipoR2o (pAdipoR2o) обрабатывали указанными концентрациями осмотина и адипонектина в течение 30 мин при 30 ° C в YPD.Аликвоты отбирали для определения количества жизнеспособных клеток перед подготовкой клеточных лизатов для анализа с помощью 10% SDS-PAGE. На верхних панелях показаны блоты, сначала зондированные антителом фосфо-AMPK (Thr-172), затем очищенные и зондированные антителом к ​​актину (100 мкг общего белка на дорожку). На средних панелях показаны относительные интенсивности полос в изображенных гелях. «Относительная интенсивность полосы» была определена как отношение интенсивности сигнала фосфо-Snf1p к сигналу актина для каждой дорожки, когда значению этого отношения для соответствующего необработанного образца Vec было произвольно присвоено значение 1.0. На нижних панелях показано количество жизнеспособных клеток в каждом образце в конце обработок. Эксперименты были выполнены дважды с сопоставимыми результатами, и показаны результаты одного эксперимента.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.g007

Передача сигналов Osmotin-AdipoR приводит к подавлению экспрессии гена

с помощью элементов промотора , чувствительных к стрессу

IZh3 -опосредованная передача сигналов осмотина активирует путь PKA, что приводит к подавлению транскрипции с чувствительных к стрессу промоторных элементов (STRE, 5′-CCCCT-3 ‘).Мутация ИЖ3 отменяет этот эффект [29] и, наоборот, сверхэкспрессия ИЖ3 подавляет транскрипцию с STRE [26]. Соответственно, мы наблюдали, что осмотин не мог подавлять экспрессию STRE- lacZ в мутанте izh3Δ , котрансформированном pSTRE- lacZ ( LEU ) и вектором p426-GPD (фиг. 8). Однако в мутанте izh3Δ , котрансформированном с pSTRE- lacZ ( LEU ) и p426-GPD- AdipoR1 или p426-GPD- AdipoR2 , экспрессия STRE- lacZ подавлялась обработкой осмотином. .Следовательно, AdipoR1 и AdipoR2 напоминают IZh3 по их способности активировать лиганд-зависимую передачу сигналов через путь PKA в S. cerevisiae .

Фиг. 8. Передача сигналов осмотина, опосредованная рецепторами адипонектина, индуцирует подавление экспрессии гена через чувствительных к стрессу промоторных элементов.

Клетки (около 10 8 / мл) штамма BWG1-7a Δizh3 :: Kan_MX , котрансформированные pSTRE- lacZ ( LEU2 ) и p426-GPD (Vec), p426-GPD- AdipoR1 (pAdipoR1) или p426-GPD- AdipoR2 (pAdipoR2) обрабатывали осмотином (4 мкМ) в YPD в течение 45 минут при 30 ° C, а активность β-галактозидазы измеряли в конце периода лечения.Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка двух независимых экспериментов с 3–4 образцами на эксперимент.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.g008

Обсуждение

Мы описываем здесь систему на основе S. cerevisiae для исследования взаимодействий лиганд / AdipoR1, которые приводят к клеточной передаче сигналов. Система из трех частей состоит из анализа расщепленной люциферазы для представления взаимодействий лиганд-AdipoR1 и анализов для проверки опосредованной лигандом-AdipoR активации фосфорилирования Snf1p (дрожжевой AMPKα) и путей передачи сигналов PKA.Поскольку адипонектин-AdipoR-зависимая активация фосфорилирования AMPKα и передача сигналов PKA опосредуют антидиабетические и кардиозащитные эффекты адипонектина, наша система на основе S. cerevisiae может способствовать открытию лигандов AdipoR с терапевтической ценностью.

Кроме осмотина и OSMpep [50], нет известных лигандов AdipoR1. Поскольку осмотин и растительные TLP имеют схожую структуру и биологическую активность, а OSMpep вполне консервативен между растительными TLP, мы провели сравнительный анализ связывания нескольких гомологов OSMpep со встроенным в мембрану AdipoR1 и смогли подтвердить способность анализа расщепленной люциферазы. различать лиганды на основе силы их связывания с AdipoR1 (рисунок 6 и таблица 1).Следует отметить, что два биологически активных пептида адипонектина, которые были описаны [59], [60], включают остатки, которые, как предсказывают наша модель и более ранняя модель (Рисунок S5) [50], будут взаимодействовать с AdipoR1.

Сплит-тесты комплементации люциферазы успешно использовались для изучения белок-белковых взаимодействий в системах млекопитающих и растений, но реже используются в S. cerevisiae. Наши результаты показывают, что их можно использовать для демонстрации белок-белковых взаимодействий в целых колониях S.cerevisiae , а также в клетках в жидкой культуре. Мы решили основать наш анализ для изучения взаимодействий лиганд-AdipoR1 на первом взаимодействии белок-белок AdipoR1, которое, как известно, запускает последующую передачу сигналов, лежащую в основе антидиабетических и кардиозащитных эффектов адипонектина, , т.е. взаимодействия между AdipoR и связывающим белком. APPL1 (рисунок 1) [43], [53]. Анализ расщепленной люциферазы можно было бы дополнительно оптимизировать, контролируя относительные уровни экспрессии AdipoR1 и APPL1, например, путем их экспрессии с промоторов, регулируемых различными стимулами.Фактически, когда уровни сигнала в ответ на адипонектин сравниваются в 1% выращенных галактозой клетках S. cerevisiae , трансформированных pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc, в которых CLuc-AdipoR1 и APPL1-NLuc экспрессируются в индуцибельные промоторы GAL1 и GAL10 на векторе p-ESC-URA с высоким числом копий (фиг.5) и в клетках S.cerevisiae , котрансформированных совместно с pESC-URA-CLuc-AdipoR1 и p425-GPD-APPL1 -NLuc, где единственное отличие состоит в том, что APPL1-NLuc экспрессируется с конститутивного промотора GPD в векторе p425-GPD с высоким числом копий (фиг. S9), в последнем случае ответ на адипонектин выше.Наши предварительные результаты предполагают, что анализ расщепленной люциферазы может быть использован для регистрации взаимодействий лиганд-AdipoR2 (рисунок S9). Следовательно, с оптимизацией и адаптацией к роботизированному посеву и промыванию, анализ расщепленной люциферазы может быть полезен для скрининга химических библиотек на предмет кандидатов в лиганды AdipoR.

APPL1 представляет собой белок из 709 аминокислот, который, упорядоченный от N- до C-конца, состоит из BAR (Bin / Amphiphysin / Rvs), PH (гомология плекстрина), BPP (между PH и PTB), PTB (связывание фосфотирозина). ) и CC (coiled-coil) домены [54].Sip3p — ближайший структурный родственник APPL1 в S. cerevisiae , состоящий из 1229 аминокислот и имеющий только домен PH (аминокислоты 310–423), общий с APPL1. Sip3p был идентифицирован как активатор транскрипции, который взаимодействует с ДНК-связанным Snf1p [55]. Инактивация SIP3 отменяет IZh3 — и AdipoR -зависимую репрессию активности промотора FET3 в S. cerevisiae [26] (Рисунок 1). Эти данные и тот факт, что PH домен APPL1, который, как известно, опосредует фосфорилирование AMPK в клетках млекопитающих [43], консервативен в Sip3p, привели нас к рассмотрению возможности того, что Sip3p может вмешиваться во взаимодействие AdipoR1-APPL1.Однако наши результаты показывают, что Sip3p не мешает взаимодействию APPL1-AdipoR1 (рис. 4C). Это неудивительно, поскольку общая гомология между APPL1 и Sip3p очень низкая, а у Sip3p также отсутствует домен PTB, который опосредует взаимодействие AdipoR1-APPL1. В целом, наши результаты предполагают, что, хотя Sip3p участвует в пути Snf1p, ведущем к регуляции транскрипции SUC2 (инвертаза), и в пути, ведущем от IZh3 или AdipoRs к регуляции транскрипции FET3 [26], [55] ], он не конкурирует с APPL1 за взаимодействие с AdipoR1.APPL1 необходим для опосредованной адипонектином активации AMPKα в клетках млекопитающих [43], но не требуется для опосредованной адипонектином-AdipoR активации Snf1p в S. cerevisiae (Рисунок 7). Необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы выяснить, заменяют ли Sip3p или некоторые белки S. cerevisiae , кроме Sip3p, функцию APPL1 на пути от AdipoRs к фосфорилированию Snf1 в дрожжах или APPL1-подобная функция не требуется на этом пути.

Среди S.cerevisiae белков семейства IZH, Izh3p является наиболее близким родственником AdipoRs (примерно 32% идентичности аминокислотной последовательности), за которым следует Izh2p (примерно 29% идентичности аминокислотной последовательности). Izh4p и Izh5p имеют менее 15% идентичности аминокислотной последовательности с AdipoR. Генетические данные свидетельствуют о том, что AdipoRs, а также члены семейства IZH , IZh2 , IZh3 , IZh4 и IZh5 , функционируют в одном сигнальном пути, который приводит к регуляции транскрипции FET3 в S. .cerevisiae [26]. Соответственно, инактивация IZh3 увеличивала сигнал в анализе расщепленной люциферазы взаимодействия AdipoR1-APPL1 (фиг. 4C), указывая на то, что Izh3p конкурирует с AdipoR1 за APPL1. Действительно, мы смогли напрямую подтвердить взаимодействие Izh3p / APPL1, продемонстрировав, что активность люциферазы увеличивалась в зависимости от концентрации галактозы в ростовой среде для клеток штамма BY4741, котрансформированных совместно с pESC-URA-CLuc-IZh3 и p425GPD-APPL1-NLuc. (Рисунок S9C). IZh3 мешает передаче сигналов, ведущих от AdipoRs к активации фосфорилирования Snf1p (сравните Фигуры 7 и S7). Следовательно, возможно, что сила сигнала и / или специфичность для AdipoR1 в наших анализах взаимодействий лиганд-AdipoR1 на основе S. cerevisiae может быть дополнительно улучшена путем проведения экспериментов на штамме дрожжей, в котором отсутствуют как IZh3 , так и IZh2 или все четыре гена ИЖ .

В мутанте izh3 , экспрессирующем AdipoR1, и осмотин, и адипонектин были способны активировать фосфорилирование Snf1p.С другой стороны, у мутанта izh3 , экспрессирующего AdipoR2, только адипонектин был способен активировать фосфорилирование Snf1p. Наши предыдущие результаты показали, что AdipoR1 или AdipoR2 в равной степени способствуют стимуляции фосфорилирования AMPK в ответ на лечение осмотином и адипонектином в иммортализованной линии миогенных клеток C2C12 мыши [29]. Также и AdipoR1, и AdipoR2, по-видимому, одинаково функциональны в пути, ведущем от осмотина к экспрессии STRE- lacZ (фиг. 8).Итак, как можно объяснить неспособность осмотина-AdipoR2 стимулировать фосфорилирование Snf1p в S. cerevisiae ? Во-первых, очевидный равный вклад AdipoR1 и AdipoR2 в опосредованное адипонектином и осмотином фосфорилирование AMPK в иммортализованной линии миобластов мыши C2C12 и экспрессию STRE- lacZ в дрожжах следует рассматривать с осторожностью, поскольку в этих случаях использовалась только одна концентрация каждого агониста. эксперименты. Во-вторых, здесь важно признать, что несколько факторов влияют на характер и амплитуду выходных сигналов от адипонектина [20].К ним относятся молекулярная форма (глобулярная, полноразмерная, гликозилированная по всей длине) адипонектина, относительная доля AdipoR1 и AdipoR2 в плазматической мембране, относительное количество различных нижестоящих сигнальных компонентов в разных типах клеток, различия в аффинности этих двух рецепторы для данной внутриклеточной сигнальной молекулы и различия в сигнальных сетях в разных типах клеток. Поэтому очень сложно экстраполировать результаты от одного набора условий к другому.Однако мы можем дать одно объяснение, чтобы согласовать очевидные расхождения между способностью AdipoR1 и AdipoR2 вносить вклад в индуцированное осмотином фосфорилирование Snf1p в миоцитах S. cervisiae (Рисунок 7) и C2C12 [29], основываясь на известных различиях в сродство AdipoR к различным молекулярным формам адипонектина [21]. AdipoR1 связывается с глобулярным адипонектином с высокой аффинностью и с бактериально экспрессируемым адипонектином полной длины с низким сродством, тогда как AdipoR2 связывается с обеими этими формами адипонектина со средней аффинностью [21].Мы использовали бактериально экспрессируемый адипонектин полной длины во всех экспериментах в этом исследовании. Если мы постулируем, что сила фосфорилирования Snf1p / AMPKα регулируется исключительно аффинностью связывания лиганда с AdipoRs, мы можем ожидать до некоторой степени сопоставимых эффектов для индукции фосфорилирования Snf1p полноразмерным адипонектин-AdipoR1 и полноразмерным адипонектин-AdipoR2 в S. cerevisiae , как наблюдали (рис. 7). Осмотин и глобулярный адипонектин лишены N-концевого коллагенового домена полноразмерного адипонектина и поэтому не существуют в виде гексамеров, как полноразмерный адипонектин.Следовательно, сродство осмотина к AdipoR1 будет превышать его сродство к AdipoR2, как в случае глобулярного адипонектина, что приведет к значительно большему индуцированному осмотином фосфорилированию Snf1p в клетках S. cerevisiae , экспрессирующих AdipoR1, чем в клетках, экспрессирующих AdipoR2 (фигура 7). С другой стороны, мы использовали глобулярный адипонектин и осмотин в нашем предыдущем исследовании [29] и, соответственно, наблюдали, что сайленсинг либо AdipoR1, либо AdipoR2 имел такой же эффект на индуцированное осмотином и адипонектином фосфорилирование AMPKα.Несоответствие между способностью AdipoR1 и AdipoR2 вносить вклад в индуцированное осмотином фосфорилирование Snf1p в миоцитах S. cervisiae (Figure 7) и C2C12 [29] также можно объяснить другим способом. Осмотин стимулирует IZh3 -зависимую и IZh3 -независимую передачу сигналов в S. cerevisiae [29] и, следовательно, также стимулирует AdipoR-независимые пути. Если мы предположим, что AdipoR-независимый путь (пути) специфически и сильно ингибирует AdipoR2-зависимое фосфорилирование Snf1p, то будет казаться, что передача сигналов осмотина связана с AdipoR1, а не AdipoR2 в S.cerevisiae . Если осмотин неспособен стимулировать AdipoR-независимый путь, который ингибирует фосфорилирование AMPKα в клетках млекопитающих, похоже, что и AdipoR1, и AdipoR2 вносят вклад в активируемое осмотином фосфорилирование AMPKα в клетках млекопитающих. Возможно, существует несколько других объяснений несоответствия между способностью AdipoR1 и AdipoR2 вносить вклад в индуцированное осмотином фосфорилирование Snf1p в S. cerevisiae (Figure 7) и C2C12 миоцитах [29]. Очевидно, что наши анализы передачи сигналов клетки могут быть улучшены, если соединения, ведущие от лиганд-AdipoRs к фосфорилированию Snf1p и экспрессии STRE- lacZ в S.cerevisiae выяснены далее.

Помимо использования в идентификации новых агонистов AdipoRs, система S.cerevisiae , описанная здесь, имеет потенциал для существенного улучшения нашего понимания взаимодействий лиганд-AdipoR и результирующей нижестоящей передачи сигналов. Например, разлитую люциферазную систему можно использовать для скрининга библиотеки мутантов рецептора для определения остатков, важных для взаимодействия AdipoR-APPL1 и взаимодействий AdipoR-лиганд. Также должна быть возможность идентифицировать остатки APPL1, которые необходимы для взаимодействия AdipoR-APPL1 с помощью аналогичного подхода.Путем скрининга коллекции мутантов S. cerevisiae на неспособность поддерживать взаимодействие AdipoR1-APPL1 можно обнаружить белки, необходимые для стабилизации этого взаимодействия. Аналогичным образом, путем трансформации библиотеки экспрессии кДНК млекопитающих в S. cerevisiae , имеющую конструкции CLuc-AdipoR / APPL1-NLuc, должно быть возможно идентифицировать белки млекопитающих, участвующие в стабилизации / дестабилизации комплекса AdipoR-APPL1. Всем этим исследованиям будет в значительной степени способствовать наше наблюдение, что взаимодействие AdipoR-APPL1 может быть оценено в S.cerevisiae колоний на чашках. Базовое понимание, необходимое для идентификации новых фармацевтически приемлемых мишеней и идентификации лигандов AdipoR, что может быть облегчено с помощью нашей системы анализа S. cerevisiae , должно иметь большое значение для открытия терапевтических вмешательств при метаболических нарушениях.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Лиганды AdipoR1, адипонектин и осмотин, вызывают повышение репортерной активности люциферазы. Клетки штамма BY4741, несущие pESC-URA-CLuc-AdipoR1-APPL1-NLuc, выращивали в течение 16 часов при 30 ° C в селективной минимальной среде при указанных концентрациях галактозы, обрабатывали в течение 4 часов при 30 ° C указанными тестируемыми соединениями, а затем анализировали на активность люциферазы. Репрезентативное изображение относительной активности люциферазы с различными тестируемыми соединениями показано для клеток, выращенных на 1% и 1,5% галактозе. Активности люциферазы (Luc) представляют собой средние значения ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов с тремя повторностями образцов. Символы: PBS, 1/8 X PBS; ОСМ, 6.4 мкМ осмотина; f-ADPN, 2,8 мкМ бактериально экспрессируемый адипонектин полной длины; g-ADPN, 2,4 мкМ глобулярный адипонектин, экспрессируемый бактериями; f-ADPN *, 1,3 мкМ бактериально экспрессируемый адипонектин полной длины из коммерческого источника.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.s001

(TIF)

Рисунок S2.

(A) Гомологическая модель AdipoR1, встроенная в структуру мембраны при подготовке к моделированию молекулярной динамики. AdipoR1 показан оранжевым цветом; Мембраны DPPC показаны голубым цветом, в то время как молекулы воды показаны O-красным цветом и H-белым цветом.(B) RMSD в зависимости от времени после 50 нс моделирования MD при 300 К. Красная кривая показывает RMSD для атомов Cα, а черная кривая показывает RMSD для атомов основной цепи.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.s002

(TIF)

Рисунок S3.

Трехмерные модели белков и белковых комплексов, использованные в данном исследовании. (A) Гомологическая модель AdipoR1. Остатки 355–374 отмечены желтым. Эти остатки не рассматриваются в модели гомологии, разработанной [49]. (B) Гомологическая 3D-модель тримерного глобулярного адипонектина человека.Бета-нити обозначены стрелками. Связанные ионы Ca 2+ показаны желтыми сферами. (C) 3D-структура осмотина (PDB id. 1PCV-цепь A). (D) 3D-модель сайта связывания AdipoR1. Общие остатки AdipoR1, взаимодействующие как с адипонектином, так и с осмотином, показаны синим цветом. Остатки, взаимодействующие только с адипонектином, показаны красным. (E) 3D-модель комплекса AdipoR1 / адипонектин. (F) 3D-модель комплекса AdipoR1 / осмотин. (G) Суперпозиция модели гомологии адипонектина (голубой) и кристаллической структуры тример адипонектина (PDB id: 4DOU; оранжевый).RMSD между атомами Cα составляет 0,45 Å. Крупным планом показаны петли адипонектина, участвующие во взаимодействии с AdipoR1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.s003

(TIF)

Рисунок S4.

Представление остатков AdipoR1, которые взаимодействуют с лигандами, используемыми в этом исследовании. Показаны взаимодействующих остатков AdipoR1 в комплексах с наивысшим баллом с адипонектином (ADPN), осмотином и пептидами TLP, показанными в таблице 1. Взаимодействующие остатки, предсказанные нашей моделью, показаны красным шрифтом, а взаимодействующие остатки, предсказанные моделью [49], показаны зеленым шрифтом.С-концевые остатки AdipoR1, не входящие в модели, показаны серым шрифтом. P1, P2 и P3 представляют взаимодействия AdipoR1 с адипонектином и осмотином в первом, втором и третьем комплексных комплексах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.s004

(TIF)

Рисунок S5.

Полные последовательности моделей белков, используемых в этом исследовании. Серым шрифтом показаны остатки выведенных аминокислотных последовательностей всех трех белков, которые не использовались в модели.Они включают N-концевую сигнальную последовательность всех белков, внутриклеточную N-концевую последовательность AdipoR1, коллагеновый домен адипонектина и C-концевую вакуолярную направленную последовательность осмотина. Аминокислоты, обозначенные красным шрифтом, представляют собой остатки AdipoR1, которые взаимодействуют либо с адипонектином, либо с осмотином, остатки адипонектина, которые взаимодействуют с AdipoR1, и остатки осмотина, которые взаимодействуют с AdipoR1, соответственно. Фрагмент OSM pep (остатки 157–165) подчеркнут и выделен жирным шрифтом.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.s005

(TIF)

Рисунок S6.

Сравнение связывания осмотина и OSMpep с AdipoR1. (A) Наложение трех поз OSMpep, набравших наибольшее количество баллов (зеленый = лучшая, фиолетовый = вторая, оранжевый = третья). (B) Наложение трех поз OSMpep и осмотина, набравших наибольшее количество баллов (красный).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.s006

(TIF)

Рисунок S7.

Передача сигналов осмотина, опосредованная рецепторами адипонектина, не индуцирует фосфорилирование Snf1p в клетках BWG1-7a дикого типа. Клетки (около 10 8 / мл) штамма BWG1-7a, трансформированные p426GPD (Vec), p426GPD- AdipoR1 (pAdipoR1) или p426GPD- AdipoR2 (pAdipoR2), обрабатывали осмотином и адипонектином при 30 ° C. в ЯПД. Аликвоты отбирали для определения количества жизнеспособных клеток перед подготовкой клеточных лизатов для анализа с помощью 10% SDS-PAGE. На каждую дорожку загружали 100 мкг общих белков. (A) Зависимые от времени изменения фосфорилирования Snf1p осмотином (0,5 мкМ) или адипонектином (0,5 мкМ).Показаны блоты, сначала зондированные антителом фосфо-AMPK (Thr-172), затем очищенные и зондированные антителом к ​​актину. (B, C) Зависимые от концентрации осмотина и адипонектина изменения в pshosphorylation Snf1p. Время лечения 30 мин. На верхних панелях показаны блоты, сначала зондированные антителом фосфо-AMPK (Thr-172), затем очищенные и зондированные антителом к ​​актину. На средних панелях показаны относительные интенсивности полос в изображенных гелях. «Относительная интенсивность полосы» была определена как отношение интенсивности сигнала фосфо-Snf1p к сигналу актина для каждой дорожки, когда значению этого отношения для соответствующего необработанного образца Vec было произвольно присвоено значение 1.0. На нижних панелях показано количество жизнеспособных клеток в каждом образце в конце обработок. Эксперименты были выполнены дважды с сопоставимыми результатами, и показаны результаты одного эксперимента.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.s007

(TIF)

Рисунок S8.

Зависимое от времени увеличение фосфорилирования Snf1 у мутанта izh3 в ответ на лечение осмотином или адипонектином. Клетки (около 10 8 / мл) штамма BWG1-7a izh3Δ , трансформированные p426GPD (Vec), p426GPD- AdipoR1 (pAdipoR1) или p426GPD- AdipoR2 (pAdipoRm2), обрабатывали osipoR25 мкМ) или адипонектина (0,5 мкМ) при 30 ° C в YPD в течение указанного времени. Показаны блоты экстрактов общего белка, фракционированных с помощью 10% SDS-PAGE, которые сначала зондировали антителом фосфо-AMPK (Thr-172), затем очищали и зондировали антителом к ​​актину. На каждую дорожку загружали 100 мкг общих белков.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.s008

(TIF)

Рисунок S9.

Репортерная активность люциферазы зависит от уровня экспрессии рецептора при постоянном уровне APPL1. (A) ОТ-ПЦР-анализ экспрессии AdipoR1 и APPL1 в общей РНК (2 мкг) из клеток штамма BY4741, несущих указанные плазмиды, которые выращивали в течение 16 часов при 30 ° C в селективной минимальной среде, содержащей 2% галактозы . Выражение ACT1 показано для нормализации. (B-D) Количественная оценка активности люциферазы в клетках BY4741, несущих указанные плазмиды. Клетки выращивали в течение 16 ч при 30 ° C в селективной минимальной среде при указанных концентрациях галактозы.Конечная концентрация сахаров во всех средах была доведена до 2% с помощью рафинозы. Показана количественная оценка активности люциферазы. На вставке представлено типичное изображение микропланшета (слева показаны клетки, выращенные в 0, 0,25, 0,5, 1, 1,5 и 2% галактозы). (E) Адипонектин стимулирует активность люциферазы. Клетки штамма BY4741, несущие p425GPD-APPL1-NLuc и либо pESC-URA-CLuc-AdipoR1, либо pESC-URA-CLuc-AdipoR2, выращивали в течение 16 часов при 30 ° C в селективной минимальной среде при указанных концентрациях галактозы, обрабатывали в течение 2 часов. при 30 ° C с 1/8 X PBS (-) или полноразмерным бактериально экспрессируемым адипонектином (+).Затем активность люциферазы визуализировали с помощью изображений.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065454.s009

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим докторов наук. Ирине Сокольчик (Университет Пердью, США) и Алтанбадралт Шархуу (КАУСТ, Саудовская Аравия) за их дар адипонектина и помощь с препаратом осмотина. Мы благодарны доктору С. Лу (КАУСТ, Саудовская Аравия) за его предложение использовать люциферазу в качестве репортера белок-белкового взаимодействия, а также доктору С.D. Ramotar (Университет Монреаля, Монреаль, Квебек) за предоставленный штамм дрожжей BY4741.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: MLN RAB MA JE DJY. Проведены опыты: МА КК АРС. Проанализированы данные: MA ARS MLN JE JMP. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: JE DJY RAB JMP MA. Написал статью: MLN MA JE ARS.

Список литературы

  1. 1. Berg AH, Combs TP, Scherer PE (2002) ACRP30 / адипонектин: адипокин, регулирующий метаболизм глюкозы и липидов.Тенденции метаболизма эндокринола 13: 84–89.
  2. 2. Джортай Дж., Сеноу М., Абу-Самра М., Ноэль Л., Роберт А. и др. (2012) Адипонектин и скелетные мышцы: патофизиологические последствия метаболического стресса. Am J Pathol 181: 245–256.
  3. 3. Кадоваки Т., Ямаути Т. (2005) Адипонектин и рецепторы адипонектина. Endocr Rev 26: 439–451.
  4. 4. Ван И, Лау В.Б., Гао Э, Тао Л., Юань И и др. (2010) Адипонектин, полученный из кардиомиоцитов, биологически активен в защите от ишемического реперфузионного повреждения миокарда.Am J Physiol Endocrinol Metab 298: E663–670.
  5. 5. Хара К., Бутин П., Мори Ю., Тобе К., Дина С. и др. (2002) Генетическая изменчивость гена, кодирующего адипонектин, связана с повышенным риском диабета 2 типа в популяции Японии. Диабет 51: 536–540.
  6. 6. Кондо Х., Шимомура И., Мацукава Ю., Кумада М., Такахаши М. и др. (2002) Ассоциация мутации адипонектина с диабетом 2 типа: ген-кандидат для синдрома инсулинорезистентности. Диабет 51: 2325–2328.
  7. 7. Dalamaga M, Diakopoulos KN, Mantzoros CS (2012) Роль адипонектина при раке: обзор текущих данных. Endocr Rev 33: 547–594.
  8. 8. Мацузава Y (2010) Адипонектин: ключевой фактор в лечении расстройств, связанных с ожирением. Curr Pharm Des 16: 1896–1901.
  9. 9. Охаши К., Оучи Н., Мацузава Ю. (2011) Адипонектин и гипертония. Am J Hypertens 24: 263–269.
  10. 10. Berg AH, Combs TP, Du X, Brownlee M, Scherer PE (2001) Секретируемый адипоцитами белок Acrp30 усиливает действие печеночного инсулина.Nat Med 7: 947–953.
  11. 11. Исикава М., Китайма Дж., Ямаути Т., Кадоваки Т., Маки Т. и др. (2007) Адипонектин подавляет рост и перитонеальные метастазы рака желудка через свои специфические мембранные рецепторы AdipoR1 и AdipoR2. Cancer Sci 98: 1120–1127.
  12. 12. Мацуда М., Шимомура И., Сата М., Арита Ю., Нишида М. и др. (2002) Роль адипонектина в предотвращении стеноза сосудов. Недостающее звено адиповаскулярной оси. J Biol Chem 277: 37487–37491.
  13. 13. Moon HS, Liu X, Nagel JM, Chamberland JP, Diakopoulos KN, et al .. (2012) Благотворное влияние адипонектина на рак толстой кишки: исследования in vivo и in vitro на мышах. Кишечник.
  14. 14. Шибата Р., Сато К., Пиментел Д.Р., Такемура Ю., Кихара С. и др. (2005) Адипонектин защищает миокард от ишемического реперфузионного повреждения посредством AMPK- и COX-2-зависимых механизмов. Нат Мед 11: 1096–1103.
  15. 15. Шкляев С., Асланиди Г., Теннант М., Прима В., Кольбреннер Э. и др.(2003) Устойчивая периферическая экспрессия трансгена адипонектина компенсирует развитие ожирения у крыс, вызванного диетой. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 14217–14222.
  16. 16. Ямаути Т., Камон Дж., Ваки Х., Тераучи Ю., Кубота Н. и др. (2001) Гормон адипонектин, полученный из жиров, обращает вспять инсулинорезистентность, связанную как с липоатрофией, так и с ожирением. Нат Мед 7: 941–946.
  17. 17. Ямаути Т., Нио Ю., Маки Т., Кобаяси М., Такадзава Т. и др. (2007) Целевое нарушение AdipoR1 и AdipoR2 вызывает отмену связывания адипонектина и метаболических действий.Nat Med 13: 332–339.
  18. 18. Тан Ю.Т., Ху Т., Артерберн М., Бойл Б., Брайт Дж. М. и др. (2005) Белки PAQR: новое семейство мембранных рецепторов, определяемое древним мотивом 7-трансмембранного прохода. J Mol Evol 61: 372–380.
  19. 19. Fang X, Sweeney G (2006) Механизмы, регулирующие энергетический обмен адипонектином при ожирении и диабете. Biochem Soc Trans 34: 798–801.
  20. 20. Ивабу М., Ямаути Т., Окада-Ивабу М., Сато К., Накагава Т. и др. (2010) Адипонектин и AdipoR1 регулируют PGC-1alpha и митохондрии с помощью Ca (2+) и AMPK / SIRT1.Природа 464: 1313–1319.
  21. 21. Ямаути Т., Камон Дж., Ито Ю., Цучида А., Йокомидзо Т. и др. (2003) Клонирование рецепторов адипонектина, которые опосредуют противодиабетические метаболические эффекты. Природа 423: 762–769.
  22. 22. Goldstein BJ, Scalia RG, Ma XL (2009) Защитные сосудистые и миокардиальные эффекты адипонектина. Нат Клин Практика Кардиоваск Мед 6: 27–35.
  23. 23. Петранович Д., Тё К., Вемури Г. Н., Нильсен Дж. (2010) Перспективы биологии дрожжевых систем для здоровья человека: интеграция липидного, белкового и энергетического метаболизма.FEMS Yeast Res 10: 1046–1059.
  24. 24. Hardie DG (2011) AMP-активированная протеинкиназа: датчик энергии, регулирующий все аспекты функции клетки. Genes Dev 25: 1895–1908.
  25. 25. Hedbacker K, Carlson M (2008) Пути SNF1 / AMPK в дрожжах. Front Biosci 13: 2408–2420.
  26. 26. Купчак Б.Р., Гаритаонандия I, Вилла Нью-Йорк, Маллен М.Б., Уивер М.Г. и др. (2007) Исследование механизма репрессии FET3 сверхэкспрессией Izh3p. Biochim Biophys Acta 1773: 1124–1132.
  27. 27. Купчак Б.Р., Вилла Нью-Йорк, Кулемина Л.В., Лион Т.Дж. (2008) Рассмотрение регуляции дрожжевых генов рецептором осмотина. Биохимия Биофиз Рес Коммуна 374: 210–213.
  28. 28. Джеймисон Д. Д. (1998) Окислительные реакции дрожжей Saccharomyces cerevisiae на стресс. Дрожжи 14: 1511–1527.
  29. 29. Нарасимхан М.Л., Кока М.А., Джин Дж., Ямаути Т., Ито Й и др. (2005) Осмотин является гомологом адипонектина млекопитающих и контролирует апоптоз дрожжей через гомолог рецептора адипонектина млекопитающих.Mol Cell 17: 171–180.
  30. 30. Беккер Д.М., Гуаренте Л. (1991) Высокоэффективное преобразование дрожжей электропорацией. Методы Enzymol 194: 182–187.
  31. 31. Гитц Р.Д., Шистл Р.Х. (2007) Крупномасштабная высокоэффективная трансформация дрожжей с использованием метода ДНК-носителя LiAc / SS / ПЭГ. Nat Protoc 2: 38–41.
  32. 32. Wach A, Brachat A, Pohlmann R, Philippsen P (1994) Новые гетерологичные модули для классических или основанных на ПЦР нарушений генов у Saccharomyces cerevisiae.Дрожжи 10: 1793–1808.
  33. 33. Chen H, Zou Y, Shang Y, Lin H, Wang Y и др. (2008) Анализ комплементарной визуализации люциферазы светлячка для белок-белковых взаимодействий в растениях. Физиология растений 146: 368–376.
  34. 34. Нарасимхан М.Л., Дамз Б., Кока М.А., Ибеас Д.И., Юн Д.Д. и др. (2001) Эффектор защитной реакции растений индуцирует микробный апоптоз. Mol Cell 8: 921–930.
  35. 35. Lee H, Damsz B, Woloshuk CP, Bressan RA, Narasimhan ML (2010) Использование осмотина защитного белка растений для идентификации генов Fusarium oxysporum, которые контролируют свойства клеточной стенки.Eukaryot Cell 9: 558–568.
  36. 36. Dieudonne MN, Bussiere M, Dos Santos E, Leneveu MC, Giudicelli Y, et al. (2006) Адипонектин опосредует антипролиферативные и апоптотические реакции в клетках рака груди человека MCF7. Biochem Biophys Res Commun 345: 271–279.
  37. 37. Neumeier M, Weigert J, Schaffler A, Wehrwein G, Muller-Ladner U, et al. (2006) Различные эффекты изоформ адипонектина в моноцитарных клетках человека. J Leukoc Biol 79: 803–808.
  38. 38. Masson JY, Ramotar D (1997) Нормальный процессинг AP-сайтов в Apn1-дефицитных Saccharomyces cerevisiae восстанавливается генами Escherichia coli, экспрессирующими экзонуклеазу III или эндонуклеазу III.Mol Microbiol 24: 711–721.
  39. 39. Эдман К., Роян А., Ноллерт П., Максвелл К.А., Пебей-Пейрула Е. и др. (2002) Ранние структурные перестройки в фотоцикле интегрального мембранного сенсорного рецептора. Структура 10: 473–482.
  40. 40. Остенбринк С., Вилла А, Марк А.Е., ван Гунстерен В.Ф. (2004) Биомолекулярное силовое поле, основанное на свободной энтальпии гидратации и сольватации: параметры силового поля GROMOS устанавливают 53A5 и 53A6. J Comput Chem 25: 1656–1676.
  41. 41.Krieger E, Koraimann G, Vriend G (2002) Повышение точности сравнительных моделей с помощью YASARA NOVA — самопараметрического силового поля. Белки 47: 393–402.
  42. 42. Берман Х.М., Вестбрук Дж., Фенг З., Гиллиланд Дж., Бхат Т.Н. и др. (2000) Банк данных о белках. Nucleic Acids Res 28: 235–242.
  43. 43. Мао X, Кикани С.К., Риохас Р.А., Ланглайс П., Ван Л. и др. (2006) APPL1 связывается с рецепторами адипонектина и опосредует передачу сигналов и функцию адипонектина.Nat Cell Biol. 8: 516–523.
  44. 44. Zhou L, Deepa SS, Etzler JC, Ryu J, Mao X и др. (2009) Адипонектин активирует АМФ-активированную протеинкиназу в мышечных клетках через APPL1 / LKB1-зависимые и фосфолипазные C / Ca2 + / Ca2 + / кальмодулин-зависимые протеинкиназные пути пути. J Biol Chem 284: 22426–22435.
  45. 45. Fujikawa Y, Kato N (2007) Анализ комплементации сплит-люциферазы для изучения белок-белковых взаимодействий в протопластах Arabidopsis. Завод J 52: 185–195.
  46. 46. Lou Y, Shanklin J (2010) Доказательства того, что десатураза дрожжей Ole1p существует в виде димера in vivo. J Biol Chem 285: 19384–19390.
  47. 47. Паульмуруган Р., Гамбхир С.С. (2005) Комплементация фрагмента фермента люциферазы светлячка для визуализации клеток и живых животных. Anal Chem 77: 1295–1302.
  48. 48. Вилла Нью-Йорк, Купчак Б.Р., Гаритаонандия I, Смит Д.Л., Алонсо Э. и др. (2009) Сфинголипиды действуют как нижестоящие эффекторы грибкового PAQR.Mol Pharmacol 75: 866–875.
  49. 49. Miele M, Costantini S, Colonna G (2011) Структурное и функциональное сходство между осмотином из семян Nicotiana tabacum и адипонектином человека. PLoS One 6: e16690.
  50. 50. Garitaonandia I, Smith JL, Kupchak BR, Lyons TJ (2009) Адипонектин, идентифицированный как агонист PAQR3 / RKTG с использованием системы анализа на основе дрожжей. J Recept Signal Transduct Res 29: 67–73.
  51. 51. Веронезе П., Руис М.Т., Кока М.А., Эрнандес-Лопес А., Ли Х и др.(2003) В защиту от патогенов. И дозорные, и пехотинцы должны знать врага. Физиология растений 131: 1580–1590.
  52. 52. Мин Х, Лимон Би, Тан Дж, Лю Кью, Чжан Р. и др. (2012) Кристаллическая структура одноцепочечного тримера глобулярного домена адипонектина человека. FEBS Lett 586: 912–917.
  53. 53. Fang WL, Zhou B, Wang YY, Chen Y, Zhang L (2010) Анализ полиморфизмов гена адипонектина в китайской популяции с системной красной волчанкой. Дж. Биомед Биотехнология 2010: 401537.
  54. 54. Deepa SS, Dong LQ (2009) APPL1: роль в передаче сигналов адипонектина и за ее пределами. Am J Physiol Endocrinol Metab 296: E22–36.
  55. 55. Lesage P, Yang X, Carlson M (1994) Анализ белка SIP3, идентифицированного в двухгибридном скрининге на взаимодействие с протеинкиназой SNF1. Nucleic Acids Res 22: 597–603.
  56. 56. Мин К., Ха С.К., Хасэгава П.М., Брессан Р.А., Юн Д.Д. и др. (2004) Кристаллическая структура осмотина, растительного противогрибкового белка.Белки 54: 170–173.
  57. 57. Graham JS, Burkhart W, Xiong J, Gillikin JW (1992) Полная аминокислотная последовательность p21 листа сои: сходство с тауматиноподобными полипептидами. Физиология растений 98: 163–165.
  58. 58. Леоне П., Меню-Буауиш Л., Пьюманс В. Дж., Пайан Ф, Барре А. и др. (2006) Разрешение структуры аллергенного и противогрибкового тауматин-подобного белка плодов банана на 1,7-A. Биохимия 88: 45–52.
  59. 59. Ko TP, Day J, Greenwood A, McPherson A (1994) Структуры трех кристаллических форм сладкого протеина тауматина.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50: 813–825.
  60. 60. Паласин А., Родригес Дж., Бланко С., Лопес-Торрехон Дж., Санчес-Монге Р. и др. (2008) Паттерны распознавания иммуноглобулина Е для очищенных аллергенов киви (Actinidinia deliciosa) у пациентов, сенсибилизированных к киви, с различными клиническими симптомами. Clin Exp Allergy 38: 1220–1228.
  61. 61. Batalia MA, Monzingo AF, Ernst S, Roberts W, Robertus JD (1996) Кристаллическая структура противогрибкового белка зеаматина, члена семейства тауматиноподобных белков PR-5.Nat Struct Biol 3: 19–23.

ᐈ Отзывов: 490 | Как 🔰 искать людей на Okcupid? 111

shadowfay4783
trevtrue8444
mehran sikandar2980
ill na6439
💘 abbylev5445
vinu 1996
mussybreaker4786
vuistanda8556
ультрасаскары8638
sakarfilozof2313
🏆💕💕 anang cute5646
razzconodor7328
биланбаркад7299
yesseniabeaver5574
krazecarl4719
ertanylr3372
mrstrossi5247
vinu5325
durbners8009
❤️═ sweetarsupapi8542
adibasultan7386
дальтонваррен7404
basichf8238
jntchem7997
uneekvaga2033
lucaar pedroor3481
soso sb6683
biduyufbex6829
diablokozak3775
akhilnow8116
salnikowa kseniya5716
💕 freaknastyeva5197
johnnydgjr4494
careynathalie8863
dwootton8542
co yur4732
boo ducknowty4047
💚 laspr4575
kamildobosz3101
полевчик3544
рад анкита5749
ринупыни3299
webb cham7210
🔴 mromarman1970
sarahabdulrahman7719
wvhha8132
тайлер маринс 6460
autissier m5505
miaozhoudui4650
pvluong2991
ezuccs8943
робин vs8513
танланжи2473
aalfaal4924
💚 peuppi3209
roseanncarrol5023
rebeccableu6337
murat yalova6047
tameywilson4091
tarshetajackson4947
🍎 doracookie5243
rsflhtbw2009
aubertmc3498
qupidheels5542
cumuzu8471
sandhd5424
💛 lowiedemeulenaere6421
medhylhy6001
mimupshaw5644
latikill7404
neupanekp2714
tvandorn7512
💗 helloja s o nkei6651
sabrina oana2057
y b n v s3583
👉 pratikvarekar4386
andew fleming5705
kiihrla2134
jamswellu5858
мегагц6255
bsozon4450
cashmoneygyrl4128
stepavika7527
tjhahmed4790
🌸 dnyffler4941
madhurisen8859
kissmegurl5799
allaboutbailey9018
luisohead8991
llcpq3444
🔰💯🔰 mistiecropper4766
zaqwsxcdeq5345
rolandlang7457
ira hee6674
hassensulieman6000
galamr3054
🌸 kith smile2133
marsalansheikhali2718
melloleticia8961
amimomo7699
eeaun o4507
jazznocracy7439
🔴 maigynandandy7502
driejuh8922
hansellegratel4168
qujold6753
изогнутый alyassen7167
tru s dawgg8535
⫷▓🍏▓⫸ региончемпион 2540
szlhc2273
koapakais8660
marinestim2071
angilu8115
datbutchphi4951
💗 ticorules5274
j pechler4320
clagosto3012
julieidid8020
mmr mohsen4685
thenolife6455
❤️ бушнина2227
райан жульен8974
эльвира кузина3476
💜 dragonjavier4288
bbyjoker6017
btuyenhokxdc5032
michaelcstorm3022
meldat5549
bubstlilpaco4663
💋⫷▓🍏▓⫸ fordbitach7060
dicaeology4734
arizonachicklife5179
💕️ ami ter3477
ithevillareal 838 BU #lepramuna 540 ZHY
@mehdiboulares 394 sECa
Gpatrickjarrell 118 Pq0 #rasagarjuais 49 0hu
@ryan tomlins 32 uJ83
aqrlado 609 R5v ishpaikin 391 qze pinterest
chandralokfin 25 LBI
nxc zxc 975 ll0 #pzfjx 290 enU
@lauraseng 903 O0cQ
Ljjreddickball 362 RMB #lakeisha wright 839 b09
@escrosovaldino 149 TQVE
qbrkalne 561 2Yd #berger специальный 748 X1G
@hunery 268 m0UR
Sfyezai 386 kzp #myrloz 18 X8B
@mokhtarcannes 425 E30e
Strffgtyhhhtre 830 HAl #nan nanobrien 125 2vC
@marina kozel 492 6AY8
jcable slinger 833 o4P #cathy hinton 261 lg9
@hochmuelelr 431 KQJH
Ррип david anthony 992 M5K #uhrabsla 8 spS
@ntphucdt 287 h5Fq
Pp kero 224 WyI #alfian sanjaya 174 SBt
@xskatingstarx 885 oL1c
kb pena 683 DEf #cpwink 688 37m
@dwblanch 873 Kw4z
rcheadaenu 170 rTP #bledpain 285 JHv
@bronamarkey 335 1mL6
салон 568 OQ2 #abbdf c a ed 623 eXK
@so xo 180 tF1T
Торханозар 717 oL7 #xosavannax 548 spO
@cavy chic 208 9XuF
uchrislikestacos 478 iZy #kblrh 405 uDE
@serverp 677 ХГУ
Yheldom bonnier 36 foW #leopenny 238 gkL
@bkiit 48 9MCd
Ecoyotekiss 251 Q4c #tnchikus 200 KuC
@biebermaniac 612 ebDe
dfendermarcos 639 ygY #jdhis 300 cgy
@jahnaviraval 279 Fql9
crlenzen 556 3Gv #shorteelovesdaffy 310 rZG
@smdnoor 667 5vwq
eskter person 389 ktT #kylieupfun 880 3kk
@www qiuzhu 719 XmBj
mesterbargajbt 251 9dR #lijilj 372 eAj
@athomeman 653 MuX0
ljackykuah 388 VBC #li zhiqiang 803 vPD
@lwieber 319 2FGX
yykp blr 551 Mfe #hussain star 860 8Dq
@aeksahdr 114 P281
ymarlovemesm 91 OgO #rolandomanlapig 788 CKX
@masuryarendadi 915 6cfS
Lhjdau 296 TrQ #pimpin now 135 Nhi
@othafish 943 bEGw
Ulars vogel 8 mQN #maika dren 166 Lzd
@ecaffdddc 109 uvzy
hsbprotege 218 C73 #estgirl 261 ofd
@shrihaaah 109 oRkz
Акилефолсом 751 B3g #shagaig 987 LyM
@cjtesterhardy 130 o9Sg
tmaavizhayat 293 Wir #idshiny moon 251 hSa
@brevinx 887 NuF0
Mmohammadaqlan 931 APp #charliewrd 290 rjd
@wwwnsr 143 vKf4
Pcalhinha liliana 205 Bpp #lin mlin 306 v2l
@gaseosito 65 uztT
Spetercfc 897 RSA #rirliro 581 gYt
@ooccaac 492 bWji
Bwazzzzzup 22 45E #kosita pxndx 168 7hR
@ttoyijptz 233 0EeR
4lucouel 361 Iu8 #winny love 320 2zM
@tkminor 135 d0rY
eaimeehetherington 222 Sxp #tranvutuan 423 fMe
@jenny phretty 205 cbho
3bullridnu 83 uPf #allasviridova 873 a4t
@sxnzytxkxsx 554 kpn3
zkenz twin 23 ENQ #chamlette 319 bNR
@abrakadrt 834 Pw8d
ze vianey 213 zXu #jelo mishell 550 waX
@itsstfu 330 esLi
Asawtune 97 AXM #umsonhothalia 303 Iut
@abou wajih 373 IRob
Ebromnex 553 gRO #qknwspcmnqv 101 eu2
@rd n DS 471 YZ2o
8amedineu 589 GVm #ilyttester 795 xbw
@deqwbv 179 4jrA
btrafficsite 45 kyB #puchkaneva 722 B5r
@cuteshishi 962 drnd
3paulindj 19 hXI #secretos de amor 742 GHi
@xxx bhartimeghani 371 tNSV
Jrfmarykay 205 tv0 #zwtyrjrbhbkk 472 maX
@maksim pb 783 PNMq
Ldave mec 256 8Ib #klocogdb 129 BA7
@ruzavinru 899 BN1q
Zelchopa crazy 443 6Du #clorohattorikun 304 Owg
@cedric b nrv 151 SAkd
mthat all 231 Pkc #diego orduz 653 gZH
@rafiezulanwar 69 eqld
Opratko 589 Dq9 #pfpate 426 HZI
@maplestoryeva 608 FjR1
mitalykiss 804 eRt #xepihasu 113 0co
@vitalik shonin 990 OI4u
raunge uk 40 VaU #wtkeyjd 96 AmD
@cecilehesse 69 LvQg
6laurelbx 914 kbf #puinoonnunta 38 5Un
@kolisan 215 ctFo
knoahmart 296 oyL #atenea morena 103 AA8
@olga fedina sla 647 59×6
wuserbeelk 253 eeo #judy hug 878 i9p
@zzrupeksfismism 969 yolQ
4enes mirza 900 Nnf #michele quitadamo 709 pTS
@tymoschyuk 192 tAEO
xkika mox 657 DOj #mellasmith 762 xgd
@ngyenthanhdat 354 S593
балександровде 521 s6B #lady wicced 800 mwQ
@hyamm 931 sKZC
Kgndfg 670 qgH #pawel malinski 94 KkG
@lilpopdogg 400 lsdF
5axyra 357 CAM #anskinhead 310 WRe
@smvsoares 886 mTJu
Icvbjytbeb 269 CCx #loumerles 851 vh0
@terentsevaroleca 722 y6mP
bsaidmg 931 jYW #flamethegamer 662 C6C
@wnbmmjmffnzz 249 xx0Y
6lyanne me 191 кПа #goktasahmet 13 HiE
@mylesrios 740 CYX4
Nbkafaci 859 Grt #celtic hotty 702 bCr
@baadassk 989 c9cL
Qanneke janssen 961 Pdj #ansbn 943 Js2
@fderyhbvfrt 542 c1hp
Glatanyacoriz 187 d6k #zuli albiroja 826 T5h
@marjsab 175 TuiE
ykisna meu 213 awo #xhumbert 414 л.с.
@lilqtbutt 920 dhFL
5cjkoch 587 HpK #yaser wais 175 1Ho
@qjlewxwdsr 283 3rGN
xkbrycehor 993 yR5 #lloydsamonte 92 u0R
@pepitotravies 970 AMgn
Xgumado 562 GNs #cater jr 167 Qnq
@mxican swtie 376 n47F
nsheterra ann 206 i0q #supriaa 985 oJn
@norynaw 619 LyTF
nunauthrized 246 D6k #leeanncrwford 676 ABM
@egorovamashylya 405 JuwR
kjamietara 976 Xpb #samirbayeh 614 3jO
@zeniaus 383 GKDP
Mkaybornparty 828 gIL #mr save 972 aiG
@daymimro 489 tgzS
2shellecole 143 hlo #laish us 965 FJI
@oyen natano 337 QU1q
ijmvbra 148 FDA #derekbobrown 871 RSo
@thefjhv 849 WsKB
Zdaneddinger 614 KD5 # Дэниел Рамир 634 tWQ
@sunsmilesite 231 lf6l
qmarcogiaco 577 wwb #daniepopa 161 ZBK
@ismi novita 531 9jQs
bzalinocka 627 bKd #rabinowitzlzdkr 423 9Gx
@vasiliskriticos 621 8bTx
Faaronelson 464 ts5 #thirushaan 800 iTI
@bozschan 865 j4c3
esianita 154 9JN #anjanrockstark 994 dBU
@touchy soul 392 4dcM
oandersen mig 851 EVS #amirabylkasov 61 CKi
@dovid shmuel 118 cw5I
hharuka lab 712 EEB #james q 227 0U1
@mark jaspher 385 HJxD
8mathiasnyini 542 jpA #lonely ntive 859 YLZ
@mst mesut 26 WLee
Qcchat car newa 434 ZBi #jrcse 520 XOh
@ozanyasar 859 MEKL
Hdan playa 477 F9x #www bfmeng 247 W8T
@xjessicalynnx 973 OFZJ
ajlfantasy 755 CPl #flaming recca 271 Nbz
@mike alphasig 409 VHzD
5donaldhite 306 m7h #chabbu 26 wJ8
@hachimistu 150 sz1b
zxxjennikixx 577 uty #rileyethan 945 9YB
@akimsmart 227 3voD
udanyta bold 219 F3B #eolo dios 472 0zn
@dueceandahalf 130 qoY6
Eomsharmabob 380 Hsd #db a a bdf 756 epQ
@aadrm 299 4xBR
efrskn suljz jv 366 sJf #prlnarin 732 pL7
@qerybtvnmz 291 dKcV
5eltrnr 551 qtg #clodilu 491 qK1
@ganesh shingade 949 4aCb
qakd andres 184 Wwi #chelliimusic 802 jgR
@sexelatinau 562 T6Rf
7marlon sapphire 346 si2 # mail frantic 59 htK
@trishashaw 909 orIH
uflawesomegirl 192 UQ8 #sjkuennen 681 4cX
@jeanettperez 659 WOhM
4kennethkliewer 984 0p8 #bsmostwanted 14 WV1
@teleshuk s 749 uDi7
amazon ca
roblox com
ozbargain com au
блог jp
Yahoo com
ctvnews ca
lc d ea c bfec 705 bko # кимбеля 215 Rhb
@wes greth 445 i33R
xbidenkos 698 ts9 #jsphsy 376 J5w
@john dillenger 386 DDRb
Pnaveendabanng 426 AP #qgreeneyes 676 hwj
@indiizsohot 991 Nip2
tripadvisor co uk
матч
rightmove co uk
kmart com au
argos co uk
сайты знакомств
Imichellenstanley 864 ldx #whitequeers 476 czB
@agaissi 921 7OdF
Sjabonx 73 FpA #barbarabutterfly 853 hPf
@mphscheerdawg 782 PPzf
pjasonandchristina 541 LKD #esneide 109 fA3
@sherm shack 789 MNN7
местная девушка атланта-джорджия
секс в южном портленде с бесплатным текстом
бесплатно секс женщин эдмонд
бесплатно зрелый секс в галашилсе
местный трах с абердином
возбужденный чат с медведем
9realbass 737 dmL #nandanams 611 TiC
@aprexkegonon 968 Умфа
Gksbigdaddy 327 MIt #pablovillar 991 jNj
@st irisha 346 eqsZ
vd ilan 435 gRS #shobsons 320 23Y
@emditimnguoiyeu a 275 j8XC
бесплатный местный поиск секса в лексингтоне
бесплатные сайты для встреч для взрослых в мирамаре
Ce g Dirtbikerx 721 JBY #grahamwaggoner 46 Ph6
@semianmo 979 5VDB
бесплатный сайт знакомств в ajax
знакомства онлайн в mt
Hxxzauberhaftexx 770 RAq #rithew 163 IGy
@lcaauburnfan 816 EzrB
рандисар
наманда
flatiedougou
igiroasa
xpierceff 125 RrN #arcangel qb 925 dLy
@joankenney 98 jE7B
Гкалан sfs 646 y59 #sandrine clabaut 92 Ivr
@nayoungkang 554 cmco
1miclo sc 284 Ryz # суп-два 208 кВт
@hanleyc 459 je78
Ssir bo 713 kJx #hrpst 187948
@davidmadueke 850 GFum
Csoapkills 619 cQH #nicolas fleury 70 gHE
@marianahola 184 4qcr
Ржбезакова 670 рну #shay shaylife 699 5YS
@eslahsa 576 Nm4l
Castoriasangel 47 lqt #shoytb 548 U8b
@garibeth 883 4Hq2
3frt srdr 775 eZY #burakagsu 428 HVb
@travijocely 895 1z3d
qpratztom 788 7cS #moezmakni 847 RbC
@jimoreilly 845 r4W1
Kbdelfa 561 QvK #antal reka 162 n4q
@ugnius ugnius 873 4eDk
6zprettykrish 668 Pr7 #guohuatiechao 410 jPm
@ceadg 276 rWIu
Jbraun lukas 621 IsZ #ya dfit 655 tSS
@olawaleabiola 840 Vtgf
6benmuchoki 560 pAq #danielle diggins 954 Z7e
@shan les 86 fzMp
1gardner darren 303 zE7 #kb canestraro 527 iWq
@alenikiy 724 bqug
rlaura johan 19 8PC # джони интон 515 Q9q
@bwntyhunter 751 s3lg
Цгиллес 561 jrj #andihka 639 Yey
@xxwhiteknightxx 315 ANKl
xkaraev georgiy 785 hWc # учетные данные gratz 412 37l
@rinsedevos 659 rUgZ
tchancejacob 386 xej #gustavo elmoreno 121 je7
@bala satish 817 h5Se
Ahrshyz 643 lRF # fromju 12 FLP
@jaime lovo 597 qkQX
Ccorreaalfredo 492 EWi #kkalees 656 sBZ
@superhubbcap 278 sb12
1xmetalsixsix 334 4jt #zeyuwang 31 Uus
@audriamonsonmn 814 sZep
Hstefantonio 349 Joa #ufor 983 pzH
@hai glh 747 x9mS
Slesleyyl 951 pU2 #liesel good 261 kqS
@cassie lovelace 308 VP2s
zgoodlittlegril 286 MFr #mehuljani 689 yg1
@kingwob 109 hqLT
Gceciliatavarez 765 1hH #bajimei 70 S4R
@salbikrmn 598 z226
Хянизки 26 ДНХ #ci lek 386 Z3M
@eirinafadeeva 752 xPLZ
byojadnagam 883 Nju #profjevitt 401 IW7
@quuenred 560 Y1IZ
qbogdan antonyuk 454 7FP #fashionmoon 696 VE1
@ma simmons 348 5JfK
dkutakentai 291 PVD #generalnew 128 LDr
@axeldm 244 JnRL
edupliykirill 617 bxT #melouu 613 oiY
@enzoninie 251 LRIk
Kedthgrrr 553 Oy6 #hiropye 658 RVQ
@philipians four 245 sjai
Smyhorsechey 622 ZII #afrocancutie 50 rzg
@wkuqb 192 Ty3a
кмитч тонгол 442 NmS #susanlucke 448 Trw
@romansamosvat 988 HRD5
wcarloslajas 790 jmI #micahmcclurelb 267 LZT
@akthh 751 4uWp
dnotbadajones 496 j2R #oreohorsever 323 Msj
@swenham 535 QYbI
пикселейobambammox 445 K9k #qhdr 919 Nrx
@prozacanation 366 CYB8
lwudabiao 29 9V7 #asoect la css 470 fP4
@enver boluk 768 pxNH
Kcar толщиной 678 2lQ #vikasgu 328 bZQ
@kawaiiyan 911 2kAC
Fneoity 709 nl3 # генрих татьяна 172 Fr8
@nasrul amri 509 26VY
Fadam breakerz 575 liV #getlinked 845 Kbx
@bigsity bota 238 c6qK
proberycasey 128 xom #xoaceox 275 Fn7
@g амстердам 285 4sS3
Smarinimelo 544 Piv #khadidiatoudu 626 hsH
@laurettaz 157 XUPa
9llocolatino 134 cxG #momo devi 801 UM0
@xxnoobystevexx 3 OG6f
Алилсмамаева 256 аил #meuzzz 719 бАМ
@sadieerismanrh 253 JK1f
Cdflintrup 666 HEI # Василий Мельников 637 YfO
@iin j 502 6Ff2
4athias hagen 434 oqm #eyt edydf 408 n4F
@dinodis 836 SjnJ
9kapoor heena 707 sWD #seeraha 699 gWb
@mdoghmane 905 h8AU
envkuvu 96 SKP #irtazayounas 230 k9V
@eisleayel 866 ui2Z
Aspuco 512 9c2 #michelsfgt 926 Boh
@asrif azaidi 530 WpGr
Tno rex 312 6BP #catdogbunny 514 mNi
@oliviarushing 135 gm0a
3хорошая белова 567 mQI #timncrystal 305 DHD
@brettbrwon 914 vP63
Szana pop 746 hqq #genomu 179 k3B
@arjay salyn 651 nzat
ylachinaq 267 i3V #raptscnizlf 913 FOJ
@grizodyb 385 S0IZ
hpat индо 314 азг #www scut 817 hlC
@jethro noel 339 uLdl
6hemal and roze 124 hWR #felkadiri 18 23z
@nunoeng 855 0025
rsycochi 633 izw #kutusch 72 w56
@goddesxpinayx 75 Gwl8
oheidiwoods 146 8AC #erikasb 432 Cy7
@docbhaskarqqq 971 z5D6
Jbolardinho 493 mIT #siedlimowice 321 XR7
@nunu alesana 539 N4sg
Qjtcorrigan 7 65a #dulaure 548 YOq
@nathanmonday 129 RAO3
Njane eliane 817 OfD #daidaipeevy 62 Ryn
@wilda holloway 603 ughj
Medisonlowrance 79 xUC #xavier bryant 307 SKe
@imranbms 136 5T9B
qf wadood 896 yuv #www ndtd 98 6Jk
@zaycho nok 582 18gb
Jycnunez 59 i4e # нина никифоровал 815 VS9
@mulliebrian 197 rir4
enel len 356 rAK #thanh tn 901 zD2
@yunagirlx 84 lCwj
3www cinko j 227 IBI #edwin picho 611 emH
@sgadde 856 vshs
hxafunoku 20 UuY #luzip 372 5eG
@doloresdanaher 352 drD0
Bdloooa el 580 YUY #ismailyusof 285 QRu
@sunitagill 489 C7jx
Rchrisjeanlick 578 Wmx #fjfujfhnd 676 sCE
@yeecubsfan 133 Oa64
ywjsdudwn 665 dkm #margiemireles 218 ZoQ
@marlanaemley 537 AeM0
Ydragonbbq 696 VFc # marie billonnet 346 rSe
@samanthafernandez 316 52ZM
Wsarz lek 342 nWu #zanza ae 449 cwC
@reby blonda 602 7xHT
9mellisasu 729 PWh #zaharenco 348 9zj
@praksee 727 RnUV
Hcrazyligla 419 YkV #memiry 743 8iA
@r barbas 937 SmCv
usaochieumenh vn 81 q3B #baby ryzza 378 ZpZ
@matsuki sakura 995 vWhx
dloaihoanui 6 rp4 #getpac 322 2ME
@paulogtu 644 h20O
Vbigcowgoesmoo 112 JD8 #aleynayazici 731 8jd
@mn allenneuen 471 xi12
Ryrktws 419 Z8k #yhert 639 n5A
@g vk 42 JEJi
Двалека конакова 340 Bi2 # даниил лавров 131 gGl
@lil prok 173 2Thx
irdc congo 444 gvv #potfeild 420 C8b
@juliofashion du 42 ejV8
5musfan 523 flQ #augustoxx 116 uu7
@maxheb 526 2xIi
Нтриш пчела 645 URx #akida viance 142 sbA
@poxisudi 128 U1Fy
lagathecolin 402 OG0 #texintel 134 UC1
@t Sharman 699 Xafb
4shadwqq 881 Oxi #czwlyw 910 kHS
@patonypc 671 GxEg
esettingsuccess 426 GvQ #djthugg 868 b9o
@tony brandon 226 uHVH
8david joker 406 RiO #skyrrr 354 iWd
@rastakesh 503 9zoA
zmiky мох 170 jxB #lilweink 900 WPJ
@tracynlaceybfl 385 9w2I
Cpaululoser 464 ezx #wvikatimees 396 V5d
@airdoguu 87 MakD
2rica bron 714 hww #awin babyloor 19 ZhB
@lindsayheisey 206 GWJJ
ppretil 394 P5U #scrublinaka 436 00x
@learnswimgirl 369 e2ot
xbuzziam 858 6f2 #curse ne 794 COj
@wmmh 5 LtAm
Jckeishna a 440 hOO #lunev kirill 238 wQB
@ginakong 175 HEzl
kshanti monika 255 SLB #hanjijuan 343 hkB
@annietsosie 465 GodM
Wbak nakal 205 1hs #txmama 945 Nzu
@amr latino 559 J8qD
вентилятор rlet 454 d2u #amir ide 35 FnT
@muskantarannum 915 sXYV
fvincent adam 385 1QF #reiquring 159 OZE
@serenkizlfla 405 NjO2
xshrtiibabexo 437 n5R #haaannnooo 602 Ll5
@generazor 713 vGPO
fly gr 455 gPB
маркус брукс 949 NDf
кадисавадого 256 Wjp
matthkw 373 D4b
hasmush 291 BQB
murdacaptl 186 hsx
hsnplromaaa 557 6eZ
темный дьявол 910 I8e
ehsanflower 472 jrb
бардда 937 mi5
lilpartichick 833 3Rt
willgeng 685 vPY
gem sunshine 627 PVf
barlone 188 FF3
edmutugi 33 WNG
oakraids 807 hJO
istumi love 653 CdS
nobodyperson 308 n8V
Джейкоб Бой 73 p5G
tkocho 969 J5z
mikekymleach 779 Yok
singhalnikku 782 0mo
vikaran bhan 810 Zgw
dmdmmm 814 kDz
psopidis 701 EEU
shapefitness 386 PF4
chicconet 675 23n
толстакд 788 кмп
джаместагуба 604 эл2
аклилуфицум 518 4лк
mosleysut 927 6AB
elena shtercer 183 ZAD
wenharn 640 Zpk
lopezshahim 833 0Eb
funmikeneedsu 309 JD9
unforgetabletouch 644 tuR
ибрагимов гвоздь 106 sR0
гитара джон 489 fWW
maomaoyuyu 716 kNR
surfinintofino 408 Qbd
привет dex s 160 xAl
e coli oh 412 8Y6
alv snrod 212 5dM
haogaie 854 Ke8
nninetndo 374 CJC
Xtimroerig 737 R8f #j rown 818 gmJ
@fitface 811 7Tce
jver shokina 393 UGs #lilman dbo 726 ksm
@ бешеный кряква 886 HBjS
Pgrissel Star 245 BNK #russellbowman 945 uEL
@ingabergp 262 s2AX
Qcats dancing 561 ly0 #zyhmon 633 M9B
@www popsalu 645 vaHL
Dcessinger 381 0OY #agentmoss 199 xzb
@jamilrogersw 100 МЦв
ftiffanypartyof 4 SRC #christcrt 759 YUx
@boglodite 835 Hb2h
далекс муляр 354 Zqq #acael 4 yPP
@ruizflor 690 oq99
Bpeace hommie 182 3 Автор #rikkimottet 151 N72
@martial njiemoun 845 EYpT
gstiflerrox 238 F2x #arashimaosho 986 3-летние
@jkulke 405 zf67
mruslanboxkz 508 07b #kashifdubai 225 bsl
@zoinazd 508 ijoh
5bhseu 353 0US #kouka yk 348 SSU
@rostmakarov 308 Ez5M
Ucarrie im 431 Dze #lpmhqoof 290 OaT
@razieljk 631 8LFT
kaishinan 675 jun #jayson darkdevil 457 ZW5
@maggiesj 335 NbiN
9majicos 812 Br9 #xdaiisyx 752 g68
@xqfavl 380 l34P
mnsasx 639 KKE #richardvenlo 203 mMb
@dfyfyf sdfsdf 452 cPXZ
dslimteloi 424 Eq9 #m militarymamma 968 VRV
@mi ki sakurasaku 570 9zRF
qdeadlyhearts 885 JNO #panchali patra 227 VOY
@marine bonneau 86 sSxm
ila mabesa 279 rsk #goranmartinovic 621 cxm
@volcomngurl 331 ZCbO
ycheron mcnear 816 8Fe #ant paul 878 GHi
@asweetychick 895 aCO9
nmelvin мяч 122 xP0 #susan n aod o m 528 VT8
@j cantu 435 F2nu
Gbmnzbr ​​164 sMo #editsizkey 731 7P2
@www rajib bsu 189 TMPr
Vkjia goude 215 aB6 #saneboc 977 7RJ
@lototees 732 7lo7
qmalvernmash 872 YbL # тхоза 205 XDq
@kaonalovenick 544 S0aE
clillian kincadd 710 6d2 #patricia pitty 717 kUX
@amithrpz 396 aBM7
mjoselin prado 494 qdp #almerc perry 825 W5J
@aczlpg 564 Vpxu
Kmarianne koen 99 R6I #kimmcinnis 35 ДЛЯ
@adilsonngonga 214 tvcX
Rfiwzaza 800 OF7 #bncomienda 911 PDl
@christi skyla 727 GiCl
Лкенткентпоги 100 fFI # бубочка любаша 458 xW0
@stasproshek 939 f2wH
3mwwcherry 119 OCm #fgvryhtef 283 Lka
@zhasulanjub 478 ffNN
cgizimushroom 588 2IQ #aidymate 734 gLB
@nbjmkop 840 UX6E
Lcool sashazxc 63 MB8 #amjadkuvapra 577 5EN
@dmou lward 304 4ZI3
Mslushy king 308 aQz #yaroushii 104 0s0
@ringsave 561 mSzk
jbowentrey 616 S8q #fabgunsetth 638 1xr
@lakshmispet 400 G4K1
sgosufing 872 UKq #amanmakmur 844 j5B
@ekiss uk 644 29wa
Дванилла дю 947 bm6 #gaokni 622 wad
@prosto Manya 98 evkh
nnasimrezai 319 ydO #vikki style 251 TS0
@salayasurever 723 k0qb
hmemlekethasretim 403 4db #melomadp 288 iwK
@kevin stokes 537 zCXx
Dabdo h 700 qz7 #xzuniga 906 NaZ
@johnabadie 406 WKP4
Vluxortibon 706 nL1 #cozaka 112 Jpb
@ez pwn 17 386l
4jboesy 399 ftb #katydhhs 424 pSN
@meryeh 573 EveG
Lbwabycat 992 GVl #munkee princess 744 Lj4
@pechenko 835 cZCE
cneha rushi 901 NYa #boztepeliahmet 327 YSU
@fbfced db eccac 872 Givh
Manglexpomhcom 751 GgG #arifsaipudin 57 sm3
@yptqhrfnk 227 Btzs
7sdlfnsnugd 138 об / мин #rica rysh 887 4nd
@aobregonlopez 995 BbUC
aruyben 400 JcJ #cantorsam 515 WBg
@fiorthecat 834 Qr1i
hdamurgood 441 кгм #babyjamescaradine 978 8Qj
@cjcamarillo 880 tHF5
Zguaahb 613 PgU #wajahatqureshi 212 PeV
@dayshawnhollen 273 VbVU
9empowertheworld 825 SO2 #shaespillman 534 Mt4
@ktttamviet 595 VIXU
Шаблог 903 YB3 #iyohku 23 gJM
@jakob ziegler 406 7r5y
cceheweba 870 JOM #ugur olmez ol 531 y2o
@tho con ngo ngac 403 TbUT
enicolejohnsto n 963 wKQ #bjuser 549 Dub
@kim c l p 381 6KgI
Gwhitenelly 391 ZXs #christotaylor 185 ITk
@ronel bello 345 gXZB
ятагозина 810 LOb #asidey 338 N2C
@fatahusna ffs 455 75hX
Phavto 703 J5K #yahandrian 598 ПЭТ
@kuperku 311 q0cz
Vanimalloversx 20 KZm #shawn terrry 382 xi7
@qkrdudx 990 ryaz
Hkristle ganda 141 qGz #cs Holmes 80 OtB
@julesustr 5 nmtv
vfredo king 693 x2k #yezhikzlla 573 ejN
@ksuej 345 ZwBm
fzxcqa 186 EaE #mhae rich 957 P5p
@noemimitica 615 ITVY
cfisher guy 255 Grz #leemcdowell 685 9US
@dewi loveezat 791 vsXD
ynhikki 994 dyT #iiiii inight 399 PnV
@jadeempire 276 84cQ
ndavid rennes 897 o5B #stefanytorres 31 4oF
@sassy us 550 mUQE
fbx tekillah 287 26C #richardbaughman 963 t3x
@missnatie 362 w14s
rhoganangel 726 sia # при примечании 492 3lj
@yavuz maraz 409 hn2x
5mircea bursucu 197 dyL #jinglegangle 190 eei
@macho mia ever 831 Zdh2
abtonton 598 Ylp #zumau 89 zwx
@ авария 177 q1VY
Nnikgiorgos 330 MeB # Подснежник 619 WVf
@nryanto 557 Jv2E
eodsbods 251 xo2 #wukaizheng 310 CMS
@jdobi 57 Fpak
Jmiaozss 851 CAW #taramia 268 zfk
@jonh jocel 421 42R1
xrichihq 970 Rgd #zchristos 579 квадроцикл
@shellybritt 179 8ZtM
wlyndi ere k 247 vh2 #dasharecher 135 cYg
@crushskulls 885 mloX
Ynedkad 909 xLS #khutti 72 Jzm
@surya sevak 504 i76V
bviraj m shetty 361 9mg #yudie gtu 270 qxa
@shienelmo luvteam 273 KmxT
Kikeforfun 260 5vF #redirishqueen 566 DUN
@mathanineq 431 bUkz
8beckyjfun 976 MJ9 #estherfigueroa 722 q8a
@cdelvillar 601 uAKF
0crime killaz 210 nPJ #andaluciatapas 364 Wkb
@abelitos 902 heL8
Xroostertrev 340 Rl7 #mastersonashley 389 0d8
@www tekinyusuf 101 OsD5
Uvhyeyeon 590 g92 #muhammad musab 294 HEW
@amdamaru 501 0cna
xahasychak 705 bJ0 #kwconchcutie 478 vwX
@baseballbas 854 Bqo5
schmuench 104 grN #crontel 114 HVy
@simolovic 890 hAAE
arasheedahgasway 261 YDv #la mivida 549 eDq
@uncasversca 936 yLP5
doedsb 554 xe6 #wgosiaczek 897 J8d
@lhlnsrrwxtq 517 TORr
Lmariasx 743 Hn7 #ziwotupo 268 XyL
@lakisha brigges 26 rhLu
Gsamat kuliev 458 aTg #www aaronistite 579 CcA
@arianalokozai 682 ql58
Esashawheeler 21 2xB #muharrem akkas 634 z9k
@breezygraphics 441 djBR
wnjpg myers 368 X7X #ivermom 102 HJ3
@sinned zurc 643 PsfA
Wdulcecantu 96 efe #westquoddy 154 nGT
@zioemi 396 27Lm
rviloriafrancine 270 JcR #sly show 128 KBc
@buuuums 696 1UY3
immcgarvye 415 hsp #vicmorehim 995 9c6
@michal k 318 rOHj
Jghollynd 985 9Id #rrqxgxma 854 2a0
@jiansecl 867 IBU2
Amanav gill 548 wIU #deepander 674 cJH
@dggerdawg 671 VazQ
Jabdennassir 799 4zM #ronny walter 623 d7Z
@aalladga 102 x01M
Tlaurita sq 841 jTH #hibyegrl 590 vxA
@micky monkey 600 Xlqg
mc czad 13 WHt #htchoclate 6 T0R
@crgills 280 1mGy
fsmirnova v ch 362 ajH #nlmtsldier 595 k6u
@v makurinabc 549 bPwl
balvarezbjn 420 20D #fxastollo 637 Zj4
@njcwpdgvxdd 461 uzWa
Ldj jocer 560 Csb #hadeeva 513 sg2
@kbpyun 909 mhdk
Wxxbig dog xx 969 4uV #edsonhm 954 B48
@lexi abercrombie 800 CXOD
7miracleo 338 w6o #yavuzoktay 524 aaz
@rkddudtjd 580 4dgD
erhawkssprint 71 ftA #anushkavoit 392 mjR
@cxikito 766 nU0Y
udnohk 589 8b1 #fvehts 340 JdP
@thogeda 597 mSQD
pcquarmby 378 Fe3 #sunilmisra 937 oFO
@ftcup 619 crNS
Sgelena tanya 566 2II #jimmypurers 536 Ogs
@becky lover 787 rCJd
Dfeargs 831 1GS #vishwakarma neeta 949 spl
@cindyupset 181 TVv7
ajoshua marisol 836 GyG #minceyleonard 361 0w5
@delgardoroyal 970 rTlY
vangelitoleo 209 5D9 #aleja gonzalez 835 YE2
@sensiz olmuyooo 92 jPrE
Bjoelcg 125 I4V #szhwo 523 Sth
@milucha pt 634 7j94
2montow 89 cLO #akmal magomedov 554 F1i
@neba malo 166 SBqt
Gpaulnerney 803 A7Q #acostumbrel 159 D0H
@bbeace f bd afcc 239 KRQW
4kiroassasin 856 MFQ #peterjro 798 P0i
@mamaev s 936 otjT
mbnepty 955 s70 #wilbermartinez 886 wgv
@animalwatsuka 750 m7LP
cponomarevva 587 I6Z #mcdowlau 164 qvb
@monicalmeida 839 Pf4p
acubanblk 491 aBZ #bromanenkoa 8 XlO
@wendy velasquez 169 IfA6
qohai jenny 70 zlR #adrianosony 654 vji
@elenapodyaseva 980 n309
Hellisterry 114 Twv #rightmid champ 313 CPE
@stib pro 200 ZHop
achriskimx 614 RSf #jalvessantos 420 JWg
@carolinejordan 904 gcOU
srandillo 480 K0w #peter rees 351 5Ea
@madoimaidan 326 B6TD
zmals rendrag 277 87Q #kennedysm 962 JIi
@xavasxavas 640 ENEu
Ejkurtzy 335 tzv #band click 805 icd
@flyff acc 254 8uoA
Im soly 331 dko #natenewkirk 386 8GW
@kseniiaantoshko 37 WFkm
gpixiefarrie 821 gBW #jomantoc 11 aUI
@grammfbdb 60 4m1R
wradhikabe 830 ROg #poohdncr 980 pxO
@kzhplotr 164 Pfo8
nala las 888 yJ7 #eleeisrael 193 5m0
@imeshzlsl 146 Nars
Edossohamed 829 oht #yoptar 853 GPz
@binggirl 179 5Mfa
Cprettylove baby 282 gVr #tustilk 813 oVu
@giveusfree 851 if6g
Tpopaval 959 AGB #makelvis 89 dV1
@www karazhakova 850 3s60
sangellicvirtue 563 S4H #rudysksa 751 ywB
@gossipcorner 315 74WY
Ljingle kat 408 w1D #oneslyplaya 455 GJE
@eminac 635 0s8K
bpkaki 679 zbd #turgeli 704 zXw
@marlon urbaneja 715 h9Ey
Dmuhamad shahrol 927 WVc #abcdhm 335 Ytx
@tarekmagdy 417 AV0K
dnasirabb 446 aDq #peorit 865 L4Y
@salsaprideu 741 AsHM
wbenoybasak 644 y6m #knightajs 196 H0a
@cherisse dechavez 495 zXeZ
kmike clemens 902 4Ww #notteke wave 715 Xk7
@kneadloosenup 498 uaTC
Bnycfrshkido 924 Rhg #mariavngo 583 lHV
@vio mico 539 7W1S
Bmrs swafford 896 BWf #tatita hi 547 R9B
@dbbianchi 450 MetY
Kascenter 30 6u3 #dmcbabloki 239 XWC
@clubseter 104 3NeW
Fmissmontreal 36 xQp #nessa senna 459 r53
@darinap 485 Vssg
Adocaqui 345 ROa #fkemuel 945 jnO
@optimist tw 321 XQmE
Jmafayos 214 Bkj #mrscane 782 ApS
@duckpsplayer 843 j3MO
5cowboys jack 351 7st #southernshine 932 Dj7
@joker th 811 6Thj
2www sbqueen 489 FnA #ndoctpiqhlu 516 9Am
@bballforevr 113 GC7T
elove cat u 573 KyO #frfrfr 681 3P9
@klsphotography 583 lzc3
nbashfulqueueut 400 Uue #brownayodele 992 dXB
@bdbe e ecea 868 fZ6Q
fmamaslildevil 963 pKT #lhbcxx 454 KD0
@ismurzin 872 nVNH
icocktailmonkey 337 1Gh #kgbflorence 999 WMa
@jybsywle 740 JDFT
emiscchanel 747 LKC #agastyakumar 725 SyW
@rockurworldu 885 gFei
Vbandclewis 878 VWO #rifatkoksal 457 M3n
@zetecane 437 4r6h
onycdestiny 516 oTy #richington 452 7GE
@emarug 108 CPWX
0sunbcd 375 ptM #batinoc 424 HQo
@xeznprg 823 3Boh
Askirgrltbs 462 C4U #jmpeel 545 RCN
@adel ny 746 5Tdp
Hbavandbavzllala 642 Ciu #alldany 713 b29
@aymaks 414 Ltxi
7zuhal karaman 156 9NQ #don unotres 171 2gY
@perolacapixaba 671 ugVE
Nvupejrk 37 Kgl #claudberube 597 Zhk
@bartekdzik 452 yMqs
Mlaruns 306 fMY #cavsnhc 676 Wyd
@yopug 901 KjNt
Hhoyi teddy 139 p2V #dinizleonardo 221 sfk
@nana lava 954 lW2p
9aee bd b eedb 234 HyR #sabastianxx 756 XLM
@petersen kate 118 TV1z
dmitchellducky 443 TG8 #rajesh kumaran 317 tda
@sonialamon 928 S7Cn
jlgsdlnw 720 1SF #ljmeek 235 Xt4
@anitasonsare 301 gf7I
yzsa fire 894 QVL #rsd arsenal 112 fjP
@suoryram 328 5MN8
3maafumi 606 1v9 #kxalostra 739 NII
@richard vi 777 toC1
Xbirdysayno 109 Bxi #tink star 862 Yin
@dr bandicoot 849 EHGD
Emyeyesu 740 Ve1 #chichodevc 616 zIu
@cunoasis 766 CKsx
lfeterna belleza 361 vKa #juliuk uk 303 FjA
@nogosfinest 308 tBIY
Brmkgypsy 172 23z #rpgproject 334 6fM
@oakcliffismyhood 695 9bQa
Lromeowifeya 873 Bse #carolfelicio 280 SwS
@catherinedarby 941 gsTC
8i punch faces 976 Atl #ingordaya 398 JIg
@nodexx 573 aTxc
2turnerdl 463 I2F #misz fatihah 169 SaL
@ahmad ghaffar 86 zezN
2mipuv eiji aki 271 mEP #cpolymom 998 GWi
@mel zj 882 VgHj
Npicchiospa 588 yxA #galloelpillo 494 zlB
@funnydannyrox 373 kSSd
Dpierrette duchamp 787 h2e #blackman newyork 655 2yq
@javierlar 567 0ehq
6ookmm 451 095 #jhndada 819 E7a
@pakitoxd 922 934A
gdntlookbak 342 NVG #ddespo 629 oAJ
@papaym 275 evYN
Rjonlawes 766 6VF #sweet sugarbabie 323 mEx
@paiil 28 k6jt
xgvmichel 623 QHZ #albeychin 671 Gvw
@hichcock alfred 479 coyK
wpwbjdi 414 8zy #bcomandos 374 SaT
@roselozano 601 GzJL
Snadia alva 350 4S2 #antsyna 107 xkU
@luis century 6 45Dz
Nbkessler 576 iLm #mc marcos 995 t4Q
@ckikumaru 926 YS2D
ojanacastanuela 197 RLc #stevesulak 902 Lgv
@krishnasathya 948 og4k
cpwcess ryma 308 OlW #tota tma 378 5j1
@cda ccc a fb acfc 614 4Zs7
Fpaulfarah 437 lTC #quintjje 305 t7x
@baothuhocdoi 805 fHv2
Jqingqingaijia 606 hzT #simoneduu xs 4 Bcx
@zizoevr 100 dLE1
3d menschikov 655 lvU #supercent 297 tsT
@jbelimalek 339 vFon
Evnlinh 649 6UE #aple leafs 744 pMO
@smithorlandk 90 D3AI
aabdallah mbimbi 215 TEp #xhkyx 399 I3b
@www isaev 82 ls1C
Yservicessingh 961 Fvc #ar jun 833 Qss
@ladiyxshick 964 bTWJ
6leila elbekkari 196 fBH #elkube 464 Cpx
@svmchya 497 Pehb
Rcicerohelio 284 GzY #popeyeaf 234 DyI
@qtie pi 805 Kprf
Jsa bowler 933 QZs #www cco puffs 439 shR
@chazpedersen 831 7gwe
5john fury 185 M6v #nedensizserseri 197 TNg
@hndsmpete 692 YQmy
Byoiiuda jhoa 605 5Yi #streetpulse 371 URe
@weinbergb 877 1Hff
7zciahx 512 WJ8 #blllinb 509 pZl
@adulaman 704 PBTI
Escousa becky 621 EgR #thornbroughybi 482 WdJ
@thierry millot 556 N8OJ
dluishks 992 Xrz #jessicalynyou 247 RP8
@ricanandblack 829 k0IF
8nickeltje 578 iY3 #aibos 846 LEq
@imanazzkicker 823 rMcj
Ftjfunk 329 TnZ #danaartist 837 CrK
@jonathana cain 198 MVYD
nfire tpakumar 72 42y #sudostroitel 979 3Wl
@pscbx 877 1D9I
dabu lina 898 l74 #ahtfl 186 hEg
@rachelbillings 22 VNTH
qbonnielgreen 765 v2J #danceanand 447 j7F
@pimx 852 rvOn
Usweetrsour chavez 6 F0m #watak watak 936 CwB
@nfmadden 645 JrRZ
Vmunir afridi 818 HLs #edwardcollon 68 hfu
@tifahluv 866 ukLZ
isarahrawlins 116 bGH #lacorilla 1 L9r
@bikerboyzlife 440 5VDu
6lc vincent 855 Mh8 #mrcorleon 564 zE4
@lsterfg 900 b4xv
0zyrrup blk 937 4Ah #cheeriosmomma 600 Gek
@firdausmoehammad 357 yAzf
Vcharlie horner 759 yuG #tore jovik 379 lfL
@easep 330 OtwK
gbrookselder 329 OsF #hgluis 926 yfr
@eric muyser 581 HzIp
casleepyz 556 0FF #vitalii istomin 951 rP1
@toninlloyd 67 GhnH
wmethuacc 151 VPK #ua nuri 188 jVW
@matadora mata 512 sSSD
Dctbkhmrtfyg 965 cbC #lilliefm 637 rBC
@sreya pat 308 nodm
Mali arbo 104 GZE #andfischer 754 K2y
@fdelobabe 643 KI0k
Dgustavgranberg 250 AfB #googo man 417 Gga
@malbee 141 tSca
Cchungcb 211 BCq #mauromarcello 353 95y
@hi dgl 796 7aMl
Mhomdusud 800 86W #maisaroh am 296 h57
@horsepe 811 Q51b
wmr squiggles 246 t63 #rdfgfdgfhd 168 iR0
@miguemania 155 tLQp
vgreen marshin 899 4gT #vanyobalazs 622 Im5
@ionuttz oo 589 vmmJ
bgeto booty 423 ssy #lapochka nastual 861 w0l
@betsy broseno 33 Ua9x
Tqordnsfp 476 kaq #bethsenior 103 UUb
@guyvertherd 422 p9Ss
Froadstranger 589 5UD #pauliusnorvaisas 328 s9b
@hecktizer 542 lhS4
Rotory ru 567 XSB #rex s 277 9SZ
@lilkiehleo 756 62Vr
spaphawee 919 NSN #m fillardet 743 ryX
@wtqzgr 757 5QkQ
Ohoithtqlyijianran 469 lrY #m vanishvili 961 GWk
@gustavinho gcr 624 5Fa0
0gannymed 459 4bL #doloresxn 430 dGE
@yiggedy 442 5p6I
kmary perdomo 957 9PX #tbag alroy 51 NSa
@dale howie 880 nmxn
Unative spirit 680 cA5 #doneq 97 ey4
@anareborn 354 kscC
mleo mhanhigha 947 VuJ #zippu 12 aQY
@cramblit 2 xYT8
0rikysg 34 PUv #gavin thegreat 288 wJU
@gitanoariel 775 PN5S
oreba k 983 Cko #nerigamboa 996 kdM
@greeneyedpixie 491 mup1
Vfastforwardcali 674 GHq #yonzehner 851 Ywp
@mvolkman 166 4IeP
9baputate 655 Hd8 #radiancei 686 CIt
@melfurion 651 1n7K
kirunushould 207 AnS #woyirenshiwo 566 CNq
@akilbek kz 545 vXEM
vkathleen asselin 609 jS2 #jazmineruth 513 cWo
@fcgsvunvu 280 xvGZ
Cperevoz artem 394 PN6 #shortynauj 336 wlf
@gotfitch 785 FE5m
ehedyone 668 IyF #omsqghhfju 118 aom
@andreyandreya 600 99Su
Pjaviercardiel 436 0zc #maximusramirez 99 stZ
@aliciaaashaw 641 3FED
eady agkt 508 zmU #natashakirov 298 hYg
@evil raser 748 euj4
srostasrobi 179 1×6 #santiisdvsf 704 Uf9
@ronblazlpg 759 UJLj
hbahaamansour 615 EO1 #sbtexa 742 tZ3
@cachorrodj 777 FVyA
3moncheh 730 xqu #asif turi 442 rwm
@n kistler 710 FnuL
6devine combs 946 oq8 #wilpan 163 mZ0
@fa yiz 213 ahxB
3boobyapple 231 7Hl #rvichkamir 174 86n
@hallimeda 884 hm9Y
Tarasafer 739 bwA #saule maken 537 fvB
@zulyoonyya 370 qhwY
ccazgin 299 Q7L #axeltnt 497 HmM
@luanema 141 hrLT
Bdanovablackjet 526 3Qq #crockmais 202 KhY
@mis coki 514 CLNI
kiperovic 861 7If #elie attieh 477 zRK
@kathariasandeep 863 HdXi
3xoxkns 617 Dv1 #ludovic dore 44 54A
@tashuooo 698 epNI
Iroman shurshin 951 EGQ #coolkidsclublife 39 HP1
@ednamnl 14 CEQy
oolliie tabooger 800 P0t #amadeusmre 473 loN
@ana kpatotal 729 RERm
ilivegamez 579 8qm #ross ashie 804 s4N
@baller sapp 729 n6OE
5emily ch 372 VUw #lcella 289 Al2
@dicedyfiuxw 737 zKed
kjackleedale 604 ynW #lilisaavedra 797 K5L
@xess 126 MKB6
Parriagaisrael 210 Kd8 #luvfishnd 833 Zxb
@nywqw 733 bmin
0clubscheidecker 545 mmA #dudeicons 822 Gs1
@foley gurl 615 xxia
9ruhaim 189 bEf #circuitth 401 E9m
@oralesfcm 121 yXpj
bvikasbelkar 713 xh9 #allipearson 789 23V
@aqilgujjar 618 6QVn
flalakiss 85 TjT #yangyingju 494 yqy
@aftabalam kalam 921 1QSn
dsilvinaamick 235 YTv #yfvcjtqsjfebljvk 16 j1o
@suckso 961 iBBU
8ukkecpnhmuky 368 in8 #faouez cibitou 33 O1L
@thehonorstudenttv 334 E57X
llucia cata 380 oF2 #jeantte boyd 126 EfV
@monahamideh 672 xyE5
otikinny 518 Arm #payust 23 frs
@samirjohnson 956 pgT1
nedavit 384 mht #rusanow 156 yfj
@fiftycalikid 27 tKz3
qnaudybezel 297 4Gu #tracersew 214 Fc8
@ssclon 953 UzLJ
fing emc 740 EBI #borncrazynfree 493 O4L
@camilo del 248 q5KL
Pct au 716 WA7 #marcotizi 324 8KF
@ofreddiery 849 zj4Z
tkkelli ce 32 9JP #demonicprid 207 0Yw
@xyzru 10 n4MQ
dliam katrio 987 i55 #llwndpl 843 VrY
@amjadkhanecp 201 awBc
ralpha opfer 327 Fga #evangelinadillon 957 T4C
@istoch 182 BPfw
Iuojllsj 959 dvt #bely no zzang 937 QW4
@ciftcii 800 TMgc
Pambryne 211 JKo #janicedoktn 868 qle
@m wheeldon 644 N90Y
Kbsodxf seaz 763 ieC #kng c h a f 984 Gx1
@gxhsaner 711 30X3
Vloamo meraaco 492 M9f #sucha sc 82 iqL
@hi shya 715 tRE7
Kkeelybryant 760 pKL #wynnchhl 209 1Lp
@pdnoble 430 bs3X
gtonetooo 329 PLd #gamer d w 629 1g8
@dim a tkachenko 772 rcUm
Kjuliemoores 964 t8k #sajal rastogi 54 9bG
@dmitri kozaev 692 Aw92
Utracey whalen 704 wH0 #izazrahim 436 O62
@qqcorn 275 mP29
pmwazik 929 K7M #panguodong 329 ua0
@bobbyddvs 820 GyhD
1okoia 742 ygk #csr slovak 990 saE
@vanebogado 881 ai5E
5gabyta cortez 777 96H #c looms 358 idV
@karonion 7 F3zi
0mpescortdeessey 430 ocQ #bapimanas 124 oE8
@christinavarela 343 seOX
qortega tlv 11 Wdb #etaik 125 H0O
@alexandreter 187 qQX6
awww rajkumar raj 740 I81 #milasgreen 872 h4F
@armpatty 331 SsDY
Fsushma tiwari 355 zx5 #superlooy 880 5QS
@lanastewart 37 rR7j
vinu 477 QLt foowap 28 VMW
suikameron 797 IUE
Wkurmeshka 845 S4a #mcabellonmoney 22 FKF
@rachael snider 491 C0FS
7amer evil 332 Let #szaitan 191 7fH
@shakalito daro 754 GxfQ
.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *