Аргиопа трехполосная: Аргиопа паук. Описание, особенности, виды, образ жизни и среда обитания аргиопы

Содержание

Тигровый паук — 60 фото

Самка и самец с паутиной


Псалмопеус ирминия



Членистоногие аргиопы


Тигровый паук ядовитый


Майский паук


Мандибул Арахнида


Крестовик обыкновенный паук


Паук Оса Аргиопа


Тигровый паук хищник


Паутина под водой



Паук Осовик


Паук Оса паук Аргиопа Брюнниха


Psalmopoeus irminia самец


Тропические жёлтые пауки


Пауки-кругопряды – Araneidae


Паук птицеед Poecilotheria


Пауки средней полосы


Тарантул казахстанский


Паутина паука Аргиопа Брюнниха


Аргиопа Брюнниха в Крыму


Тигровый паук


Linothele фаллакс


Аргиопа тигровая


Зебра агриопа


Маленькие паукообразные


Linothele fallax (линотеле фаллакс)


Аргиопа трехполосная


Редкие пауки мира


Паук линотеле


Аргиопа Брюнниха (паук-Оса)


Тигровый паук серая МОРФА


Тигра паук


Avicularia versicolor самка


Отряд пауки представители


Металлический Тарантул


Красивый паук разноцветный


Картинка паук на Тигре


Паук птицеед Poecilotheria Metallica


Паук Арахнид


Прядущий Мизгирь


Тарантул птицеед


Фиолетовый птицеед


Желтый паук


Паук птицеед


Граммостола Актеон


Как зовут паука


Паук птицеед Cyclosternum fasciatum


Китайский паук


Linothele fallax (линотеле фаллакс)


Африканский паук птицеед


Аргиопа тигровая


Аргиопа Брюнниха паутина


Каракурт, Тарантул Крестоносец


Паук кругопряд полосатый


Паук Аргиопа паутина


Пауки среднего Поволжья


Тигровый птицеед


Логово паука

Растительный и животный мир Кугея

nature-azov.

ru|nature-azov.ucoz.net|nature-azov.ru

Ростовская обл., Азовский р-н, с. Кугей. 30.08.2018

Фото Александры Лисицыной

 

Пауки обычно у большинства людей вызывают или подсознательный ужас, или брезгливое отвращение. Арахнофобия, как ни странно, свойственна очень многим. Теоретически – потому что пауки ядовиты. Но! Из нескольких тысяч их разновидностей ядовитых наскребется от силы сотни полторы, остальные для людей безопасны. Второе объяснение – отвратительный вид. Однако самый опасный паук – птицеед – напоминает плюшевую игрушку. А небольшой его соплеменник, аргиопа Брюнниха, вообще отличается нарядным, чуть ли не праздничным видом. Так что арахнофобия – нечто иррациональное, а пауки сами по себе достойны внимания и интереса, как и любое другое произведение природы. 

Даже яростным противникам арахнидов паук аргиопа Брюнниха кажется красивым. В народе он более известен под другими именами: паук-оса, паук-тигр, реже – паук-зебра. И все благодаря яркой, самобытной, запоминающейся окраске.

При полном соответствии паучьему телосложению, животное имеет характерную осиную (или тигриную) расцветку: желто-черные полосы. Если приглядеться, то они перемежаются с белыми линиями, но издалека раскраска полностью соответствует той, которую имеют осы. Ноги паука тоже окольцованы контрастными полосами – создается явное впечатления, что на них натянуты чулки. Четко на четвертой, если считать от головогруди, полосе имеются два заметных бугорка, а по краям брюшка присутствуют выемки (всегда шесть, но окрашенные по-разному: оттенки варьируются от невыразительно-темного до ярко-оранжевого). Нестандартно у паука-осы и расположение конечностей. Две пары ориентированы строго вперед, две оставшиеся – четко назад. Визуально боковые опоры отсутствуют, что нехарактерно для большинства арахнидов, у которых лапки расположены перпендикулярно поверхности. Впечатляющими размерами аргиопа Брюнниха похвастаться не может. Самцы никогда не превышают в «росте» семи миллиметров – большинство людей их и не заметят, тем более что окраска у них довольно тусклая.
Самки будут покрупнее: могут достигать 2,5 сантиметров, отличаясь яркими, издалека заметными цветами. 

Ареал, который уверенно освоил паук аргиопа Брюнниха, довольно широк. В него включены многие страны Европы, юг (а с недавнего времени – и средняя полоса) России, Крым, север Африки, южноазиатские территории, Япония с Китаем. Селятся эти пауки на лугах, по обочинам даже довольно оживленных дорог, на опушках, в руслах пересохших речушек. Аргиопа – ловчий паук; из засады не охотится, а поджидает добычу в сетях. Основой рациона у него являются кузнечики, мухи, кобылки и осы. 

Как все сетевые пауки, аргиопа Брюнниха готовит ловушки, растянутые между травинками и низко расположенными ветками кустов. Сети у этого вида арахнидов круговые, в центре имеют зигзагоподобный рисунок, свойственный плетениям всех собратьев по роду Argiope и называемый стабилиментумом. Несмотря на небольшие размеры охотника, ловушки у него получаются очень прочными, способными удержать кузнечика, который крупнее хищника в 2-3 раза. На создания сетей, которые плетутся в момент захода солнца, в наступающих сумерках, аргиопа Брюнниха тратит всего час. Для поджидающей добычу аргиопы недостаточно просто сплести сеть. Владелец ловушки сидит в ее центре, в том самом зигзагообразном сегменте, и ждет жертву, держа в конечностях моток созданных нитей. Когда добыча поймана, охотник опутывает ее паутиной и кусает. Насекомое от яда умирает; параллельно оно начинает частично перевариваться, находясь еще не в жвалах паука. 

Пауки вида Аргиопа Брюнниха занимаются вопросом оставления потомства в период линьки, когда самка уже сбросила предыдущий хитин, а новым еще не обросла. После того как самец сделал свое дело, партнерша в подавляющем большинстве случаев его съедает. Иногда «бравый молодец» успевает оплодотворить вторую даму, но до третьего подхода, по данным ученых, ни один не доживал. Существует теория, что каннибализм паучьего слабого пола вызван нехваткой белка, нужного для развития наследников. Впрочем, сильно сочувствовать их «мужчинам» не стоит: самка-аргиопа ненадолго переживает своего «мужа».

После создания коконов и откладывания в них яиц (до 400 штук в каждый «кувшинчик») паучиха-оса гибнет. Потомство же зимует в созданных ею домиках, а по весне выбирается из них полностью самостоятельным. 

Паук аргиопа Брюнниха: ядовитый или нет? Вопрос потенциальной опасности всей ползающей братии волнует людей в первую очередь. Не избежала подобной участи и аргиопа Брюнниха. Ядовитая или нет эта разновидность пауков, спрашивать некорректно. Строго говоря, все арахниды ядовиты, другое дело, что далеко не все представители вида способны прокусить кожу настолько, чтобы их отрава добралась хотя бы до капилляров. Так что, даже не проводя лабораторных испытаний, можно с уверенностью сказать, что аргиопа Брюнниха – ядовитая букашка. В конце концов, именно ядом она «усмиряет» своих жертв. И для насекомых он смертелен. Другое дело – человек. Его размеры несопоставимы с теми, которые имеет аргиопа Брюнниха. Укус этого паука, следовательно, для людей относительно безобиден. Его можно сравнить с ужаливанием осой (паук оправдывает свое второе имя).

Ощущения довольно болезненны, впоследствии может наблюдаться опухание и зуд, но опасности укус аргиопы не представляет. Пострадать от него может разве что аллергик. Но те же неприятности ему принесет укус любого насекомого, вплоть до комара. — Читайте подробнее на FB.ru: http://fb.ru/article/207749/argiopa-bryunniha-yadovitaya-ili-net

Источник: fb.ru

 

 

 

Садовые пауки: черный и желтый паук, коричневый и другие (изображения)

Садовый паук ( Argiope aurantia ) — черно-желтый паук, который часто встречается в конце лета. Садового паука, также называемого желтым садовым пауком, можно узнать по его желто-черным отметинам и восьми длинным тонким лапам. Садовый паук (

Argiope aurantia ) также имеет имена зигзагообразный паук, кукурузный паук, паук на молнии, паук Стилера, золотой садовый паук, пишущий паук, золотой шар-ткач и паук Мак-Кинли.


Черно-желтый паук ( Argiope aurantia ) ядовит и может сильно укусить, но это не смертельный паук. Тем не менее, обращаться с этим пауком следует осторожно, чтобы его не укусили.


Эта статья представляет собой руководство по идентификации черно-желтого садового паука. Позже вы найдете информацию о том, как определять другие виды обычных садовых пауков.

Факты о черном и желтом пауках

Желтый садовый паук (Argiope aurantia) — крупный паук с длинными ногами, который может кусаться, когда ему угрожает опасность.


Черно-желтый садовый паук ( Argiope aurantia ) — крупный вид пауков рода Аргиопа и класс Арахнида . В Argiope aurantia разновидность является частью группы пауков плетения кругов. Название «плетение сфер» относится к круглым узорам, которые эти пауки плетут на своей липкой спиральной паутине.

Желтый садовый паук ( Argiope aurantia ), как правило, безвреден, хотя может вызвать болезненный укус. Садовые пауки, как правило, быстро убегают, если вы нарушаете их среду обитания. Однако они укусят, если почувствуют угрозу.

Черные и желтые пауки встречаются в самых разных средах обитания. Обычно этих больших пауков можно встретить в садах в конце лета. В отличие от некоторых видов пауков, паук садовый (

Argiope aurantia) плетет паутину на открытом воздухе, где ловит насекомых. Эти большие пауки обычно свешиваются вверх ногами в центре своей паутины в ожидании добычи.


Самки желтых садовых пауков откладывают яйца в коричневый мешочек диаметром до 1 дюйма (2,5 см). В каждом мешочке может быть до 1000 яиц. Взрослые пауки погибают во время первых заморозков. Весной из мешочка вылупляются молодые пауки.

В летних садах вы обычно замечаете пауков-самок, которые ждут в больших круглых паутинах.

Как выглядит садовый паук?

Садового паука Argiope aurantia можно узнать по привлекательным черным и желтым полосам и пятнам на брюшке.


У пауков-ткачей садовых кругов есть яркие желтые и черные зигзагообразные узоры на брюшке.

Вы также заметите белую голову на верхнем конце их удлиненного овального тела. Эти восьминогие членистоногие имеют ноги с оранжево-желтыми и черными полосами. Самки черного и желтого пауков имеют размах ног около 7,5 см.

Черные и желтые пауки имеют характерный вид на своей паутине. Их длинные тонкие ноги создают своего рода Х-образный силуэт Андреевского креста. Обычно паутины пауков-самцов и самок держат вместе пары ног. Издалека черно-желтые садовые пауки выглядят так, будто у них всего четыре ноги.

Черные и желтые полосы и отметины Argiope aurantia взглянуть на них угрожающе. Но обычно не о чем беспокоиться, поскольку их поразительный вид — это маскировка или средство защиты от более крупной добычи.



Идентификация черного и желтого паука

Черно-желтый паук ( Argiope aurantia)

может быть идентифицирован по его черному телу с ярко-желтыми отметинами. Золотисто-желтые отметины в основном находятся на брюшке. Иногда брюшко самки выглядит так, как будто оно имеет черно-белый зигзагообразный узор. Их длинные ноги в основном черные со светло-коричневыми полосами.

Мужской садовый паук против. Самка садового паука

Самка паука Argiope aurantia (слева) и самец (справа)

Самцов садовых пауков легко отличить от самок. Самка садового паука — характерный черный паук с желтыми полосами. Пауки-самцы в Argiope aurantia виды — коричневые пауки без черных и золотых отметин. Пауки-самцы не такие большие, как самки — общая черта среди большинства видов пауков.

Самцы коричневых садовых пауков обычно более замкнуты, чем самки. Если вы видите в своем саду виды этих пауков, то обычно это черные и желтые пауки-самки, а не коричневые пауки-самцы на круговой паутине.

желтые цветы, похожие на подсолнухи

Что ест черный и желтый паук?

Обычные садовые черные и желтые пауки питаются тля , осы, пчелы , и другие мухи и насекомые . Черно-желтые самки или коричневые самцы пауков в паутине ждут, пока их поймают. Как только насекомое перестает двигаться, паук оборачивает свою еду шелковистой паутиной. Затем паук приближается, чтобы убить, и вводит яд в муху или насекомое.

У самок пауков также есть интересные пищевые привычки. Ночью самки черно-желтых садовых пауков поедают собственные сети. Затем они прядут новые, готовые поймать больше добычи, чтобы съесть на следующий день.

Жизненный цикл садового паука

Обычный садовый паук живет чуть больше года. Откладывая сотни яиц в один или несколько мешочков, самка доживает до первых заморозков после спаривания. Коричневый садовый паук-самец обычно погибает после спаривания. Крошечные детеныши пауков вылупляются весной или в конце лета, в зависимости от климата.

В теплом климате самки черных и желтых пауков могут жить долгие годы.

Родом ли черный и желтый садовый паук из Северной Америки?

Черные и желтые садовые пауки родом из Северной Америки. Вы можете найти этих обычных черно-желтых полосатых пауков в садах почти во всех штатах США и в некоторых частях южной Канады.

Подходит ли черный и желтый паук для садов?

Черные и желтые полосатые пауки полезны для биоразнообразия вашего сада. Обычные садовые пауки ловят и питаются разрушительными летающими насекомыми, такими как тля. Как и многие полезные насекомые, черные и желтые садовые пауки способствуют процветанию экосистемы вашего сада. Большинство летающих насекомых попадают в сети своих сфер, если влетают в них, и это помогает.сдерживать популяции насекомых.

Кусает ли садовый паук?

Садовые пауки кусаются, но это случается редко. Хотя обычные садовые пауки выглядят агрессивно с их черно-золотыми или черно-белыми полосами, они относительно робки. Они с большей вероятностью убежат, если вы его потревожите. Однако, если вам случится схватить один из них, садовые пауки могут вас укусить.

Ядовиты ли черный и желтый паук?

Черные и желтые садовые пауки содержат яд, который может вызвать покраснение и опухоль, если они вас укусят. Однако их укус обычно не вызывает осложнений, а боль и отек сравнимы с укусом пчелы.

Следует помнить, что лишь некоторые пауки могут укусить. Токсины садовых пауков не опасны для жизни. Существует всего четыре вида опасных пауков, обитающих в Северной Америке. Эти опасные пауки — черная вдова, паук-бродяга, желтый мешок и коричневый отшельник.

что это за дерево

Другие виды пауков, обитающих в саду (с фотографиями и руководством по идентификации)

Черные пауки с желтыми полосами распространены во многих садах Северной Америки. Но с учетом того, что в садах США обитает более 3000 видов пауков, велика вероятность, что у вас будет больше, чем обычных пауков с желтыми шарами.

Вот еще несколько видов пауков, которых вы можете встретить у себя перед домом или на заднем дворе.

Пауки-ткачи сфер

Паук-ткач (Verrucosa arenata) распространен в Северной Америке в лесах, садах или прячется в темных местах.

Черно-желтые садовые пауки — разновидность пауков, плетущих сферы в семье. Araneidae . Однако в США есть сотни видов пауков-шарообразных. Вы можете идентифицировать ткачей сфер по их сети круглой формы. Однако существует множество вариаций между видами ткачей круговоротов.

Идентификация паука-ткача сфер: Ткачи сфер обычно идентифицируются по выпуклому овальному брюшку и красочным отметинам. Помимо черно-желтых, разновидности пауков-шарообразных могут быть коричневыми, оранжевыми, коричневыми и белыми. Как правило, пауки-шаровары имеют зигзагообразный или полосатый рисунок брюшка. Еще одна отличительная черта ткача сфер — их длинные тонкие ноги.

Банановые пауки (

Нефила )

Банановые пауки имеют продолговатое коричневое тело с полосатыми лапами.

Эти большие черные пауки, также называемые гигантскими деревянными пауками или золотыми ткачами, также имеют желтые полосы. Из-за этого трудно отличить банановых пауков от обычных садовых пауков. Однако есть несколько способов отличить этих похожих шаровых пауков.

Идентификация бананового паука: Банановые пауки имеют продолговатое квадратное тело, а не округлое. Ноги бананового паука не сгруппированы попарно, как у садовых пауков, а равномерно распределены по всему телу. Эти большие пауки плетут гигантские сети длиной до 3 футов (1 м).

Полосатый садовый паук (

Трехполосная аргиопа )

Полосатый садовый паук имеет желтые, белые и коричнево-черные полосы на ногах и теле.

Полосатые садовые пауки родом из Северной Америки. Этот паук получил свое название от темно-коричневых или черных полос на рыжевато-коричневом животе и ногах. Этих коричневых садовых пауков также называют паукообразным пауком.

Идентификация полосатого садового паука: Полосатые садовые пауки имеют желтые, белые и черные полосы на брюшке. По форме паук выглядит как закругленный треугольник длиной до 1 дюйма (2,5 см). У этих коричневых садовых пауков длинные полосатые ноги, сгруппированные попарно, как у обычных садовых пауков.

Мешковые пауки (Семейство пауков

Clubionidae )

Желтые маленькие пауки-мешочки обычно встречаются в садах, но в холодную погоду заходят в дома.

Наиболее распространенные пауки-мешочки, обитающие в Северной Америке, — это северный жёлтый паук-мешочек ( Cheiracanthium mildei) и американский паук желтого мешочка ( Хейракантий в комплекте) . Желтые пауки-мешочки известны своим ядовитым болезненным укусом и быстрым бегом. Эти светло-коричневые или желтые пауки вторгаются в дома осенью, когда прохладная погода. В соответствии с исследователи , желтые пауки-мешочки являются причиной большинства укусов пауков в США.

Идентификация паука с желтым мешочком: Желтые пауки-мешочки — это маленькие светло-коричневые пауки, вырастающие до 0,4 дюйма (1 см) в длину. Пауки-мешочки имеют слегка опушенное тело и коричневые лапы с более темными когтями на конце. Желтые пауки-мешочки живут под корой, между листьями или на растениях.

Травяной паук (Семейство пауков

Agelenidae )

Травяной паук Agelenopsis pennsylvanica (слева) и паук-бродяга Месторождение Эратигена; (верно)

Травяные пауки — это садовые пауки среднего размера с пушистыми коричневыми телами и темными полосами. Вы также заметите, что у пауков длинные тонкие лапы с перемычками. Укусы большинства видов травяных пауков безобидны. Однако паук-бродяга ( Месторождение Эратигена; ) может вызвать болезненный укус. У них также есть собирательное название пауки-воронки.

Идентификация травяного паука: Травяные пауки — это, как правило, маленькие пауки размером от 0,6 до 0,8 дюйма (1,5–2 см) в длину. У этих быстро движущихся коричневых пауков есть две темно-коричневые линии, проходящие по всей длине головы и тела. Травяные пауки проводят большую часть своего времени в садах и редко выходят в закрытые помещения.

Волчьи пауки (

Lycosidae )

Пауки-волки имеют пушистое полосатое тело и болезненный укус.

Пауки-волки похожи на травяных пауков, но у них более волосатое тело, и они могут причинить болезненный укус. Пауки-волки уникальны в классе Арахнида так как у них отличное зрение. Глядя на фотографии этих пушистых коричневых пауков, вы увидите их восемь глаз, расположенных в три ряда.

Из-за своего поведения и цвета этих пауков также называют коричневыми пауками-охотниками.

Идентификация паука-волка: Пауков-волков можно отличить по пушистому коричневому телу и более темным полосатым отметинам. У пауков-волков обычно ноги того же цвета, что и их тела. В зависимости от вида пауки-волки могут иметь коричневые и оранжевые или коричневые и черные отметины. Пауки-волки вырастают до 1,3 дюйма (3,5 см) в длину.

Filmy Dome Spider (

Neriene radiata )

Пауки с пленчатым куполом имеют темно-коричневое и желтое или белое тело с тонкими длинными ногами.

Пауки с пленчатым куполом — коричневые пауки с гладким телом, принадлежащие к роду Нериене . Пауки с пленчатым куполом плетут горизонтальную паутину как разновидность паука-ткача. Вы часто будете видеть этих тонких пауков, свисающих вверх ногами со своих паутины, пока они ждут свою добычу.

Идентификация паука с пленочным куполом: Пауков с пленчатым куполом можно узнать по их тонкому темно-коричневому телу с желтыми или белыми отметинами и увеличенным щупальцам (антенноподобным отросткам на голове). Пауки с пленчатым куполом имеют длинные тонкие ноги от светло-коричневого до коричневого цвета. Этих пауков обычно можно встретить в садах под упавшими бревнами.

Западные пауки-рыси (

Oxyopes scalaris )

Маленький западный паук-рысь имеет коричневое тело с колючими полосатыми ногами.

Родом из Северной Америки, западные пауки-рыси — это маленькие коричневатые пауки с колючими ногами. Западные пауки-рыси обычно встречаются в садах среди высокой травы и другой растительности. Они получили свое название от того, как они преследуют свою добычу — подобно тому, как ведет себя дикая кошка.

Идентификация паука западной рыси: У западных пауков-рысей компактное тело бронзового цвета и полосатые ноги. Вы можете быстро идентифицировать пауков-рысей по шипам на их ногах, придавая длинным ногам зазубренный, колючий вид. Пауки-рыси вырастают до размеров от 0,15 до 0,6 дюйма (1,5 см).

Охотник на мокриц (

Дисдера крокатная )

Охотник на мокриц — красновато-коричневый паук с большим ротовым аппаратом и гладким телом.

Охотники на мокриц — это вид пауков от красного до оранжевого цвета с блестящим гладким телом. Свое общее название паук получил от своей добычи — мокрицы. Другие названия этого вида пауков — пауки-совы, охотники за пилюльками и пауки-слейтеры. Вы найдете охотников на мокриц под бревнами, камнями и листьями.

Идентификация пауков мокриц: Пауки мокрицы — это непрядильные пауки с большой темно-красной головой и тонким желто-коричневым брюшком. Вблизи вы увидите, что их хелицеры (ротовой аппарат) непропорционально велики для размера паука. Пауки мокрицы вырастают до 0,6 (1,5 см) в длину.

Пауки-охотники (Семейство пауков

Sparassidae )

У пауков-охотников коричневое или серое волосатое тело с большим размахом ног.

Пауки-охотники — большие коричневые пауки с огромными длинными ногами. Из-за их устрашающего вида и длинных ног этих пауков еще называют гигантскими пауками-крабами и пауками-ящерицами. Пауки-охотники также похожи на птицеедов и могут сильно укусить. Пауки-охотники имеют размах ног до 6 дюймов (15 см) с маленькими телами длиной 0,7 дюйма (1,8 см).

Идентификация паука-охотника: Отличительной особенностью пауков-охотников являются их крабоподобные лапы. Большинство видов пауков-охотников имеют оттенки коричневого или серого с пушистым телом. Очень немногие из этих пауков имеют опознаваемые отметины.

Цветочные крабовые пауки (

Misumena vatia )

Маленький цветок крабовый паук (золотарник крабовый паук) может быть белым или желтым с овальным коротким телом и крабоподобными ногами.

Цветочные крабовые пауки ( Misumena vatia ) могут быть белыми или желтыми пауками в зависимости от цветов, с которых они охотятся. У этих необычных пауков овальное короткое тело с восемью крабоподобными ногами. Поскольку пауки иногда могут быть желтыми, их называют банановыми пауками. Желтые или белые крабовые пауки питаются шмелями, мухами, кузнечиками и бабочки .

Другое название цветочных крабовых пауков — золотарник-крабовый паук. Подобно крабам, эти пауки могут ходить боком.

Идентификация цветочного краба-паука: Цветочные крабовые пауки — это маленькие пауки желтого или белого цвета. Их отличительной чертой является овальное тело, похожее на шампиньон с восемью крабоподобными ногами.

Серебряный садовый паук (

Серебряная аргиопа )

Серебряный садовый паук: вид сверху (слева) и снизу (справа)

Серебряные садовые пауки — это пауки, плетущие сферы с коричневыми или оранжевыми зигзагообразными узорами на брюшке. У этого вида самки пауков примерно в три раза больше самцов. Серебряные садовые пауки встречаются в более теплых штатах США, таких как Флорида, Техас и Калифорния.

кактус с красным шаром на вершине

На орбитальной сети серебряные садовые пауки создают Х-образную форму своим телом и ногами. Их большое брюшко имеет серебристый вид с нижней стороны и роговидные выступы. У некоторых видов этих садовых пауков на теле есть оранжевые, желтые или белые полосы.

Идентификация серебряного садового паука: Серебряные садовые пауки имеют тело серебристого цвета и могут иметь черные, оранжевые, желтые или белые отметины. Другой отличительной чертой этих садовых пауков-кругопрядов являются длинные черные или коричневые лапы с характерными полосами.

Узнать о другие распространенные пауки, которых можно найти у вас дома или в саду .

Статьи по Теме:

Черно-желтый садовый паук

(Argiope aurantia)

Черно-желтый садовый паук поджидает насекомое, которое застрянет в сети.

Заявление об ограничении ответственности в отношении здоровья и медицины Нажмите здесь

Диапазон

Обычно встречается в США, Канаде, Мексике и Центральной Америке.

Описание

Argiope aurantia — это паук-шар. Пауки-сферические паутины плетут свои сети по кругу.Общие названия, используемые для Argiope aurantia, — это черный и желтый садовый паук, писающий паук, банановый паук и кукурузный паук. Этот паук не опасен для человека.

  • Самцы 0,2 — 0,35 дюйма в
  • Самки 75 -1,1 «
  • 4 пары ног с желтой, красной или оранжевой окраской по направлению к верхней части ног около живота
  • На каждой ступне по 3 когтя
  • Брюшко овальной формы, черного цвета с желтыми или оранжевыми отметинами
  • Короткие светлые волосы на головогруди (передняя часть тела)

Среда обитания

Черно-желтые садовые пауки часто живут около открытых полей в более высоких зарослях и растительности.Они также встречаются в садах и карнизах домов и построек. Они выбирают солнечные участки без ветра.

Паутина может достигать двух футов в диаметре. Они имеют круглую форму и расположены на высоте от 2 футов до 8 футов над землей. Паутина садового паука отчетливая. Паутина имеет плотный участок шелка по направлению к центру сети, который образует зигзагообразный узор, называемый стабилизацией. Цель стабилизации обсуждается. Его можно использовать в качестве камуфляжа, чтобы предупредить птиц о присутствии паутины или привлечь добычу.Наличие стабилизации характерно только для пауков, которые активны в светлое время суток.

Паутина Argiope aurantia может достигать двух футов в диаметре.

Поведение

Самец садового паука обычно строит свою меньшую паутину рядом с паутиной самки. Паутина самки обычно больше, чем у самца, и ее можно определить по Z-образной вертикальной линии в средней части паутины. Самки обычно остаются на территории и часто используют одну и ту же сеть в течение всего летнего сезона, в то время как самцы бродят.

Пауки тусуются около центра паутины, ожидая, когда добыча попадется в их паутину. Если хищники находятся поблизости, пауки могут спрятаться в ближайших кустах или на землю, чтобы укрыться.

Каждый день паук съедает часть внутренней части своей паутины и восстанавливает ее из свежего шелка. Считается, что часть паутины, которую съедает паук, может содержать мелкие питательные частицы, такие как крошечные насекомые.

Диета

Пауки плотоядны.Более крупные самки черного и желтого пауков могут потреблять добычу до 200% своего собственного размера, хотя они предпочитают более мелких существ ( Экология питания паука-кругопрядителя Argiope aurantia [Araneae: Araneidae] в хлопковой агроэкосистеме, Nyffeler et al. 1987). Основной рацион желтого садового паука состоит из летающих насекомых, таких как тли, кузнечики, осы (некоторые виды), пчелы и мухи. Они поджидают, обычно в положении головой вниз к центру своей паутины, чтобы насекомое застряло в липкой шелковой части паутины.Затем паук совершает волнообразное движение, которое помогает еще больше поймать свою добычу. Затем жертва парализуется, когда паук вводит ей яд. Паук плетет шелковый мешок вокруг мертвого насекомого, чтобы спасти его, пока оно продолжает охоту. Паук съест мертвое насекомое позже.

Репродукция

Желтые садовые пауки размножаются один раз в год. Самка откладывает от 1000 до 4000 яиц в нескольких мешочках (от 1 до 4). Мешочки для яиц коричневого цвета и сделаны из шелка.Самка чаще всего прикрепляет мешочки с яйцами к центру паутины, где она может легко их охранять. Она охраняет свои яйца, пока не умрет, обычно во время первых заморозков. Самцы умирают после размножения и иногда съедаются самками пауков. Яйца вылупляются поздней осенью / зимой, а молодые птенцы остаются в мешочке до весны. Когда весной вылупляются яйца, очень крошечные паучки рассеиваются. Некоторые путешествуют по ветру, используя нить шелковой паутины, чтобы летать в воздухе, в то время как другие остаются в этом районе, чтобы охотиться и строить свои собственные сети.

Хищники

У желто-черного садового паука много хищников, включая птиц, ящериц, землероек и несколько видов ос. Люди тоже хищники.

Интересные факты

  • Слово aurantia происходит от латинского слова aurantium, что означает апельсин, плод.
  • Желтые садовые пауки могут укусить, если их беспокоить, но они безвредны для человека.
  • При угрозе черно-желтый садовый паук будет трясти паутиной, заставляя их казаться больше, чем они есть на самом деле.
  • Stabilimenta, или зигзагообразная вертикальная область паутины, напоминает письмо, благодаря которому этот паук получил одно из их общих имен «пишущий паук».

наверх

Заявление об ограничении ответственности в отношении здоровья и медицины

Информация, представленная на этом веб-сайте и на этом веб-сайте через контент, предоставленный Авторами или сторонними поставщиками, а также в других источниках, на которые она ссылается, ПРЕДНАЗНАЧЕНА ТОЛЬКО ДЛЯ ИНФОРМАЦИОННЫХ ЦЕЛЕЙ и не должна использоваться для диагностики или лечения проблемы со здоровьем. или болезнь.

Информация, предоставленная DesertUSA и ею, НЕ ЯВЛЯЕТСЯ ЗАМЕНАМИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ. Если у вас есть проблемы со здоровьем или вы подозреваете, что у вас проблемы со здоровьем, вам следует проконсультироваться с лечащим врачом или специалистом.

Если вы не можете согласиться с данным Заявлением об отказе от ответственности в отношении здоровья и медицины, вам не разрешается использовать этот веб-сайт, и вам следует немедленно выйти.

Поделиться этой страницей в Facebook:


Информационный бюллетень DesertUSA — Мы рассылаем статьи о походах, кемпингах и местах для изучения, а также о животных, полевых цветах, информации о растениях и многом другом.Зарегистрируйтесь ниже или узнайте больше о новостной рассылке DesertUSA здесь . (Это бесплатно.)

Окружающая среда пустыни
Пустыни Северной Америки
Геологические термины пустыни

(PDF) Кандидаты в гены шелка яичной оболочки паука Argiope argentata по результатам анализа дифференциальной экспрессии генов

Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S. и Li, W. (2012) CD- HIT: Acceler-

предназначен для кластеризации данных секвенирования следующего поколения.Био-

информатика 28: 3150–3152.

Гарб, Дж. Э., Аюб, Н. А. и Хаяши, К. Ю. (2010) Распутывание

эволюция паучьего шелка с концевыми доменами спидроина. BMC Evol

Biol 10: 243.

Гарб, Дж. Э. и Хаяши, С. Ю. (2005) Модульная эволюция яичных генов шелка

через суперсемейства пауков, плетущих круговые орбиты.

Proc Natl Acad Sci USA 102: 11379–11384.

Гейтси, Дж., Хаяси, К., Мотрюк, Д., Вудс, Дж. И Льюис, Р.

(2001) Экстремальное разнообразие, сохранение и конвергенция

последовательностей паутинного шелка и фиброина.Наука 291: 2603–2605.

Grabherr, M.G., Haas, B.J., Yassour, M., Levin, J.Z., Thompson,

D.A., Amit, I. et al. (2011) Сборка полноразмерного транскриптома

из данных RNA-seq без эталонного генома. Нат Биотех —

№ 29: 644–652.

Guerette, P.A., Ginzinger, D.G., Weber, B.H. и Gosline, J.M.

(1996) Свойства шелка, определяемые специфической для железы экспрессией семейства генов паутинного фиброина. Наука 272: 112–115.

Гулиа-Нусс, м., Nuss, A.B., Meyer, J.M., Sonenshine, D.E., Roe,

R.M., Waterhouse, R.M. и другие. (2016) Геномное понимание

клещевого вектора болезни Лайма Ixodes scapularis. Nat Com-

mun 7: 10507.

Haas, B.J., Papanicolaou, A., Yassour, M., Grabherr, M., Blood,

P.D., Bowden, J. et al. (2013) De novo реконструкция последовательности транскрипта

из РНК-seq с использованием платформы Trinity для генерации и анализа эталонов

. Nat Protoc 8: 1494–

1512.

Хаяси, С.Ю., Шипли, Н.Х. и Льюис, Р.В. (1999) Гипотезы

, которые коррелируют последовательность, структуру и механические свойства белков паучьего шелка. Int J Biol Macromol 24: 271–275.

Hinman, M.B. и Льюис, Р.В. (1992) Выделение клона-

, содержащего второй шелкопряд драглайна. Драглайн Nephila clavipes

шелк — это двухбелковое волокно. J. Biol Chem. 267: 19320–19324.

Hong, L.Z., Li, J., Schmidt-K €

Untzel, A., Уоррен, W.C. и Barsh,

G.S. (2011) Цифровая экспрессия генов немодельных организмов.

Genome Res 21: 1905–1915.

Ху, Х., Колер, К., Фалик, А.М., Мур, А.М.Ф., Джонс, П.Р.,

Спаркман, О.Д. и другие. (2005) Яичный белок-1. Новый класс

белков шелка с фиброиноподобными свойствами от паука

Latrodectus hesperus.J Biol Chem 280: 21220–21230.

Ху, X., Колер, К., Фалик, А.М., Мур, A.M.F., Джонс, П.Р. и

, Вьерра, К.(2006) Ядро-волокна корпуса паучьего яйца: тримерные комплексы

сплетений, собранные из TuSp1, ECP-1 и ECP-2. Biochem-

, истрия 45: 3506–3516.

Хуанг, X. и Мадан, А. (1999) CAP3: программа сборки последовательности ДНК

. Genome Res 9: 868–877.

Hulsen, T., de Vlieg, J. и Alkema, W. (2008) BioVenn — веб-приложение

для сравнения и визуализации биологических списков

с использованием диаграмм Венна, пропорциональных площади. BMC Genomics 9: 488.

Кирс, М., Мойр, Р., Уилсон, А., Стоунз-Хавас, С., Чунг, М.,

Старрок, С. и др. (2012) Geneious basic: интегрированная и расширяемая настольная программная платформа

для организации и анализ данных последовательности

. Биоинформатика 28: 1647–1649.

Ковур, Дж. (1987) Сравнительная структура и гистохимия

органов, продуцирующих шелк у паукообразных. В Экобиологии пауков

(Nentwig, W., ed.), Springer Verlag, Berlin.

Lane, A.K., Hayashi, C.Y., Whitworth, G.B. и Ayoub, N.A.

(2013) Экспрессия комплексных генов в железах драглайнов, производящих шелк, у западной черной вдовы (Latrodectus hespe-

rus). BMC Genomics 14: 846.

Langmead, B. and Salzberg, S. (2012) Быстрое выравнивание с пропуском чтения —

с Bowtie 2. Nat Methods 9: 357–359.

Лэнгмид, Б., Трапнелл, К., Поп, М. и Зальцберг, С.Л.

(2009) Сверхбыстрое и эффективное с точки зрения памяти выравнивание коротких последовательностей ДНК

с геномом человека.Genome Biol 10:

R25.

Ли, C.S.L., Моура, П.А., Миллер, Э.А. и Фидок, Д.А. (2008)

Plasmodium falciparum Sec24 отмечает переходную ER, которая

экспортирует модельный груз через диацидный мотив. Mol Microbiol 68:

1535–1546.

Li, W. и Godzik, A. (2006) Cd-hit: быстрая программа для кластеризации

и сравнения больших наборов белковых или нуклеотидных последовательностей.

Биоинформатика 22: 1658–1659.

Любовь, М.И., Хубер, В.and Anders, S. (2014) Умеренная оценка —

кратного изменения и дисперсии для данных РНК-seq с

DESeq2. Genome Biol 15: 550.

Marchler-Bauer, A., Derbyshire, M.K., Gonzales, N.R., Lu, S.,

Chitsaz, F., Geer, L.Y. и другие. (2015) CDD: сохраненная база данных домена

NCBI. Нуклеиновые кислоты Res 43: D222 – D226.

Мун, М.Дж. и Тиллингаст, Э.К. (2004) Производство шелка после

механической стимуляции растяжения в ампулированных шелковых железах

амбарного паука Araneus cavaticus.Entomol Res 34: 123–

130.

Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. and Wold,

B. (2008) Отображение и количественная оценка транскриптов млекопитающих —

томов RNA-seq. Нат методы 5: 621–628.

Ошлак, А. и Уэйкфилд, М.Дж. (2009) Смещение длины транскрипта в данных

РНК-seq сбивает с толку системную биологию. Biol Direct 4: 14.

R Core Team (2015). R: Язык и среда для статистических вычислений. Фонд R для статистических вычислений,

Вена, Австрия.https://www.R-project.org/.

Робинсон, доктор медицины, Маккарти, Д.Дж. и Смит, Г.К. (2010) edgeR:

— пакет биопроводников для анализа дифференциальной экспрессии

цифровых данных экспрессии генов. Биоинформатика 26: 139–140.

Rodr

ıguez-Esteban, G., Gonz

alez-Sastre, A., Rojo-Laguna, JI,

Sal

o, E. and Abril, JF (2015) Цифровая экспрессия генов

подход с использованием нескольких наборов данных РНК-seq для обнаружения необластов

транскрипционных изменений в Schmidtea mediterranea.BMC

Genomics 16: 951.

Sampath, S. и Yarger, J.L. (2015) Структурный гистерезис в шелках пауков-паук

, индуцированный сверхсокращением: исследование микродифракции рентгеновского волокна

. RSC Advances 5: 1462–1473.

Шмидер Р. и Эдвардс Р. (2011) Контроль качества и обработка метагеномных наборов данных до

. Bioinformatics 27: 863–

864.

Sim ~

ao, F.A., Waterhouse, R.M., Ioannidis, P., Kriventseva, E.V.

, Здобнов Е.М. (2015) БУСКО: оценка полноты сборки и аннотации генома

с однокопийными ортологами

. Биоинформатика 31: 3210–3212.

Старрет, Дж., Гарб, Дж. Э., Куэлбс, А., Азубуике, У. and Hayashi,

C.Y. (2012) Ранние события в эволюции генов паучьего шелка.

PLoS ONE 7: e38084.

Тарик, М.А., Ким, Х.Дж., Джеджелоу, О. и Пурманд, Н. (2011)

Анализ полнотранскриптомной РНКseq из незначительного количества

общей РНК.Нуклеиновые кислоты Res 39: e120.

Консорциум генных онтологий (2015) Консорциум генных онтологий

sortium: в будущем. Нуклеиновые кислоты Res 43: D1049–

D1056.

Tillinghast, E.K. и Таунли М.А. (1994) Шелковые железы пауков аранид

. In Silk Polymers, Vol.544 (Comstock, MJ (ed.), Pp.

29–44. Американское химическое общество, Вашингтон, округ Колумбия.

Кандидаты в гены шелка яичной оболочки для A. argentata 767

V

C2016 Авторы.Молекулярная биология насекомых, опубликованная John Wiley & Sons Ltd

от имени Королевского энтомологического общества, 25, 757–768

Экономическая дилемма между системами оружия может объяснить арахно-атипичный яд у пауков-ос (Argiope bruennichi)

Abstract

Пауки используют яд для подавления своей добычи, но мало что известно о разнообразии ядов в разных семействах пауков. Учитывая ограниченные данные, доступные для пауков-ткачей (Araneidae), мы выбрали паука-оса Argiope bruennichi для подробного анализа.Наша стратегия объединила конвейер транскриптомики, основанный на нескольких сборках, с рабочим процессом двойной протеомики, включающим параллельные методы масс-спектрометрии и электрофоретическое профилирование. Мы обнаружили, что удивительно простой яд A. bruennichi имеет нетипичный состав по сравнению с ядами других пауков, особенно с участием представителей суперсемейства CAP и других, в основном высокомолекулярных белков. Мы также обнаружили подмножество потенциально новых токсинов, подобных нейропептидам.Мы обсуждаем потенциальную функцию этих белков в контексте уникального охотничьего поведения пауков-ос, которые в основном полагаются на шелк, чтобы поймать свою добычу. Мы предполагаем, что простота яда эволюционировала для решения экономической дилеммы между двумя конкурирующими, но метаболически дорогими системами оружия. Это исследование подчеркивает важность передовых методов для охвата более мелких линий ядовитых видов, которые еще предстоит детально охарактеризовать, что позволяет нам понять биологию их ядовитых систем и использовать этот богатый ресурс для трансляционных исследований.

1. Введение

Пауки — разнообразные и богатые видами членистоногие, завоевавшие большинство наземных местообитаний. 48 463 существующих вида пауков (World Spider Catalog, 2020) имеют общий план тела, который мало изменился за ~ 380 миллионов лет эволюции. Пауки также обладают уникальным биохимическим набором инструментов, который использует комбинацию яда и шелка для подчинения добычи, что способствует их эволюционному успеху (Garrison et al., 2016). Более того, они представляют собой единственный отряд наземных животных, в котором почти все современные виды обладают функциональной системой яда и, таким образом, считаются наиболее успешной группой ядовитых животных (Saez et al., 2010). Соответственно, пауки как ядовитые хищники играют ключевую экологическую роль, поддерживая равновесие в популяциях насекомых (Riechert, 1974).

Яды представляют собой сложные смеси низкомолекулярных соединений, пептидов и белков, которые действуют как токсины, нарушая важные физиологические процессы при попадании в жертву (Fry et al., 2009; Nelsen et al., 2014). Они используются для защиты, хищничества или сдерживания конкурентов, но во всех случаях это физиологически дорогие черты, которые были оптимизированы сильным давлением отбора для выполнения определенных функций.Эта эволюционная оптимизация часто приводит к высокой селективности и целевой биоактивности, а это означает, что яды животных теперь считаются ценными биоресурсами в области открытия лекарств (Holford et al., 2018). Некоторые препараты-блокбастеры были получены из компонентов яда (Holford et al., 2018), но они также были исследованы в качестве исследовательских инструментов, косметики, промышленных ферментов или биоинсектицидов (например, Duterte and Lewis, 2010; Pennington et al., 2018; Dongol et al., др., 2019; Saez, Herzig, 2019).

Яды пауков имеют тенденцию быть химически более сложными, чем яды других животных, и у одного вида может присутствовать до 1000 различных компонентов яда (Herzig, 2019; Langenegger et al., 2019). Было подсчитано, что сумма всех ядов пауков может в конечном итоге дать 10 миллионов биоактивных молекул, но к настоящему времени обнаружено только 0,02% этого разнообразия (Pineda et al., 2018; Lüddecke et al., 2019). В ядах пауков было обнаружено несколько многообещающих лекарств-кандидатов от инсульта, боли, рака и нервных расстройств (Osteen et al., 2016; Chassagnon et al., 2017; Ричардс и др., 2018; Wu et al., 2019). Основными компонентами этих ядов пауков являются пептиды низкомолекулярного ингибитора цистеинового узла (ICK) с надежными третичными структурами, обусловленными наличием мотива псевдоязычного узла переплетенных дисульфидных связей (Pallaghy et al., 1994; Norton and Pallaghy, 1998; Langenegger et al. др., 2019). Такие пептиды, также описываемые как узелтины, часто являются нейротоксичными и чрезвычайно устойчивыми к нагреванию, осмотическому стрессу и ферментативному перевариванию, что делает их идеальными кандидатами в лекарственные препараты (Langenegger et al., 2019). Хотя пептиды ICK обнаружены в ядах других членистоногих (например, von Reumont et al., 2017; Drukewitz et al., 2018; Drukewitz et al., 2019; Özbek et al., 2019), разнообразие этих пептидов в ядах пауков беспрецедентно . Примерно 60% всех компонентов яда пауков, доступных в UniProt (The UniProt Consortium, 2019), являются пептидами ICK, поэтому эти пептиды обычно воспринимаются как основной компонент ядов пауков (например, Langenegger et al., 2019).

Анализ ядов ранее основывался на методах фракционирования, которые требовали больших количеств исходного материала (например,г. Friedel и Nentwig, 1989; Харди и др., 2013). Таким образом, предыдущие исследования ядов пауков были сосредоточены на видах с сильными антропоцентрическими связями, например, на тех, которые представляют прямую медицинскую угрозу или имеют необычайные размеры, что делает яд более доступным в достаточных количествах. Этот анализ ограничен членами семейств Atracidae, Ctenidae, Theraphosidae, Sicariidae и Theridiidae, которые представляют собой узкую выборку разнообразия пауков (Lüddecke et al., 2019; World Spider Catalog, 2020).Совсем недавно появление высокопроизводительных методов, совместимых с крошечными образцами, предоставило средства для расширения масштабов таких исследований на менее доступные виды (von Reumont, 2018; Herzig, 2019). Комбинации геномики, транскриптомики, протеомики и микробиомики (например, Oldrati et al., 2016; Ul-Hasan et al., 2019, Drukewitz & von Reumont 2019) теперь позволяют анализировать яды из ранее игнорировавшихся таксонов (например, von Reumont et al. , 2014) в новой области, известной как современная эволюционная яд (von Reumont, 2018).

Некоторые из наиболее богатых видами ветвей пауков вообще не были изучены в контексте ядовитых систем (см. Herzig et al., 2019 и Lüddecke et al., 2019). Поэтому в этом исследовании мы рассмотрели семейство Araneidae (ткачи круговоротов), которое является третьим по величине семейством пауков, включающим 3078 ныне существующих видов (World Spider Catalog, 2020). Ткачи сфер создают заметные и часто большие сети, похожие на шары, для кормления, привлекая интерес эволюционных биологов (например, Bond et al., 2014; Fernandez et al., 2014). Об их ядах известно немного, и только один вид (китайский ткач круговоротов Araneus ventricosus ) был исследован с использованием ядовитого подхода (Duan et al., 2013; Liu et al., 2016).

Мы выбрали осу-паука Argiope bruennichi , который имеет осиноподобный узор полос, который, возможно, развился как миметический предупреждающий признак (Bush et al., 2008). Этот вид используется в качестве модельного организма для исследования половой жизни. диморфизм, химическая экология, репродуктивное поведение, анализ микробиома и расширение ареала, связанные с изменением климата (например,г. Chinta et al., 2010; Велке и Шнайдер, 2010; Циммер и др., 2012; Уайлдер и Шнайдер, 2017; Кори и Шнайдер, 2018; Ганске и Уль, 2018; Sheffer et al., 2019; Крехенвинкель и Тауц, 2013; Крехенвинкель и Пекар, 2015; Krehenwinkel et al., 2015, Zhang et al., 2016). Его яд был извлечен для анализа биологической активности, но не был подробно проанализирован (Friedel and Nentwig, 1989). Мы применили передовой рабочий процесс протеотранскриптомики, в котором автоматизированная стратегия множественной сборки используется в качестве первого шага для идентификации и аннотирования транскриптов, специфичных для ядовитых желез.Они сопоставляются с протеомными компонентами, обнаруживаемыми непосредственно с использованием двух параллельных масс-спектрометрических (МС) платформ для достижения исчерпывающего и чувствительного обнаружения и идентификации белков. Мы обсуждаем функциональные компоненты яда в контексте охотничьего поведения на осовых пауков, когда шелк, а не ядовитый укус, является основным оружием, используемым для подавления добычи (Eisner and Dean, 1976).

2. Материалы и методы

2.1 Сбор образцов и подготовка образцов для транскриптомики и протеомики

Четырнадцать A.bruennichi взрослых самок было собрано в сентябре 2018 г. в Гиссене, Германия (N 50.5729555 ° / E 8.7280508 °). Ядовитые железы вырезали из анестезированных CO 2 образцов под стереомикроскопом, промывали дистиллированной водой и погружали в фосфатно-солевой буфер (PBS). Яд высвобождали путем осторожного сжатия пинцетом, и экстракты центрифугировали (10000 × g, 10 мин, комнатная температура) для осаждения обломков клеток перед объединением супернатантов для лиофилизации. Оставшуюся ткань ядовитой железы переносили в 1 мл раствора RNAlater, объединяли и хранили при –80 ° C.Остальные ткани тела обрабатывались таким же образом.

2.2 Общий рабочий процесс протеотранскриптомики

RNA-Seq был использован для идентификации транскриптов из ядовитых желез и оставшихся тканей тела с последующей сборкой и автоматической аннотацией. Неочищенный яд анализировали с помощью одномерного (1D) и двумерного (2D) полиакриламидного электрофореза (PAGE) перед тем, как использовать два параллельных метода MS для идентификации белков яда. Первый — это МС с лазерной десорбцией с использованием матрицы, время пролета (MALDI-TOF) -MS для характеристики интактных пептидов, полученных из 2D-гелей, а второй — ионизация электрораспылением с помощью жидкостной хроматографии (nanoLC-ESI) -MS для характеристики пептидных фрагментов непосредственно из образцы сырого яда.Транскрипты, соответствующие белкам, идентифицированным с помощью MS, затем анализировали более подробно, исследуя дифференциальную экспрессию и аннотации. Рабочий процесс представлен на рисунке 1.

Рисунок 1:

Рабочий процесс протеотранскриптомики для характеристики яда A. brunnichi . Были секвенированы и собраны транскриптомы ядовитых желез и тканей тела. Неочищенный яд анализировали с помощью 1D / 2D-PAGE перед комбинаторной MALDI-TOF-MS и nanoLC-ESI-MS. Окончательную сборку транскриптома использовали для поиска пептидов MS.Затем были исследованы специфичные для яда транскрипты, соответствующие обнаруженным белкам, с точки зрения уровней экспрессии и аннотаций.

2.3 Транскриптомика ядовитой железы и тканей тела

2.3.1 Выделение и секвенирование РНК

Выделение и секвенирование РНК было поручено Macrogen (Сеул, Корея). После экстракции РНК библиотеки были сконструированы с использованием набора TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 (парный конец, длина считывания 151 п.н.). Качество контролировалось проверкой размеров фрагментов, обогащенных ПЦР, на биоанализаторе Agilent Technologies 2100 с чипом DNA 1000.Количество библиотеки определяли методом количественной ПЦР с использованием стандартного раствора для быстрой количественной оценки библиотек и калькулятора (Roche). Библиотеки секвенировали на платформе Illumina HiSeq.

2.3.2 Сборка, аннотация и количественная оценка транскриптома

Данные транскриптома были обработаны с использованием модифицированной версии нашего собственного конвейера сборки и аннотации с различными контейнерами докеров для повышения воспроизводимости (Озбек и др., 2019). Все контейнеры (таблица S1) были созданы с помощью Nextflow v19.01.0 (https://www.nextflow.io/). Вкратце, все входные последовательности были проверены с помощью FastQC v0.11.7 перед обрезкой в ​​Trimmomatic v0.38 (Bolger et al., 2014; Andrews, 2019) с использованием настроек 2:30:10, LEADING: 5, TRAILING: 5, SLIDINGWINDOW: 4:15, и МИНЛЕН: 75. Урезанные чтения были скорректированы с помощью Rcorrector v1.0.3.1 (Song & Florea, 2015) и собраны de novo с использованием конвейера, включающего Trinity v2.8.4 (Grabherr et al., 2011; Haas et al., 2013) и rnaSPAdes v3.12 (Бушманова и др., 2019) с исправлением ошибок и без него. Все контиги были объединены в единую сборку, в которой были объединены транскрипты от всех ассемблеров, если они были идентичны. Считывания были переназначены на сборку с использованием Hisat2 v2.1.0 (Kim et al., 2019), а значения экспрессии (транскриптов на миллион, TPM) были рассчитаны с помощью stringtie v1.3.5 (Pertea et al., 2013; Pertea et al., 2016). Файлы SAM и BAM были преобразованы с помощью Samtools v1.9 (Li et al., 2009). Затем с помощью Transdecoder v5 были предсказаны открытые рамки считывания.0.2 (Haas et al., 2013) и аннотированные на уровне аминокислот с использованием поиска Interproscan v5.35-74 (Jones et al., 2014) и BLASTX v2.6.0 + (Camacho et al., 2009) против Swissprot, Базы данных Toxprot (Консорциум Uniprot, 2019) и Arachnoserver (Pineda et al., 2018). Полученная в результате сборка была использована в качестве видоспецифической базы данных для идентификации белков, обнаруженных с помощью MS. Сборки, необработанные данные секвенирования и файлы транскодера доступны по номеру XXX. Номера доступа будут добавлены при принятии рукописи XXX.

Чтобы избежать чрезмерной интерпретации наших данных, анализ дифференциальной экспрессии был применен к двум образцам (ядовитая железа по сравнению с оставшейся тканью тела), и только предполагаемые компоненты яда, полученные из транскриптов с logFC> 2 в наборе данных ядовитых желез, были рассмотрены далее. Этапы фильтрации выполнялись в рамках TBro v1.1.1 (Ankenbrand et al., 2016).

2.4 Протеомика яда

2.4.1 Фракционирование белков яда с помощью PAGE

Для 1D-PAGE яд смешивали с трициновым буфером для образцов (Bio-Rad) до общего объема 12 мкл и инкубировали в течение 5 мин при 95 ° C. ° C.Затем образец загружали в 16,5% гель Mini-PROTEAN Tris-Tricine (Bio-Rad) в камере Mini-PROTEAN Tetra System (Bio-Rad) с использованием рабочего буфера 10x Tris-Tricine / SDS (Bio-Rad). Электрофорез проводили при 100 В в течение 100 мин, и полосы белка детектировали с помощью красителя Flamingo (Bio-Rad).

Для 2D-PAGE загрязняющие вещества удаляли из экстракта яда путем осаждения 200 мкг белка смесью 1: 4 (об. / Об.) Хлороформ / метанол (Wessel and Flugge, 1984). Осадок белка повторно растворяли в 260 мкл буфера для лизиса (6 M мочевина, 2 M тиомочевина, 4% CHAPS, 30 мМ DTT и 2% буфер IPG GE Healthcare, pH 3–10).Полоски GE Healthcare IEF (pH 3–10NL, 13 см) загружали образцом путем регидратации в течение 22 часов, а изоэлектрическое фокусирование проводили при градиентах 0–100 В / 1 мА / 2 Вт в течение 5 часов, 100–3500 В / 2 мА / 5 Вт в течение 6 часов и 3500 В / 2 мА / 5 Вт в течение 6 часов с использованием системы Multiphor II (GE Healthcare). Затем полоску IEF уравновешивали в течение 15 минут в 5 мл исходного уравновешивающего раствора (6 М мочевина, 4% SDS, 0,01% бромфенолового синего, 50 мМ трис-HCl, pH 8,8, 30% (об. / Об.) Глицерина), содержащего 65 мМ DTT. , а затем 15 мин в том же растворе, содержащем 200 мМ йодацетамида.Белки разделяли во втором измерении на 14% полиакриламидном геле SDS (Laemmli, 1970) в ячейке Hoefer600 (GE Healthcare) в течение 15 минут при 15 мА (пределы 100 В / 15 Вт) и 4 часа при 150 мА (400 В). / 60 Вт ограничения). Белки выявляли с помощью красителя Flamingo (Bio-Rad).

2.4.2 MALDI-TOF-MS

2D-гель анализировали с помощью PDQuest (Bio-Rad), и 152 пятна (таблица S2) вырезали с помощью резака ExQuest Spot Cutter (Bio-Rad) и переносили в 96-луночные планшеты. (Greiner Bio-One). Образцы обрабатывали одновременно с использованием робота-дозатора MicroStarlet (Hamilton Robotics) для выполнения следующих шагов: вырезанные гелевые пробки обесцвечивали 25 мМ гидрокарбонатом аммония, содержащим 50% (об. / Об.) Ацетонитрила, обезвоживали 100% ацетонитрилом, регидратировали в 50 мМ гидрокарбонате аммония, дегидратированном 100% ацетонитрилом, высушенном при 56 ° C, регидратированном 17 мкл 25 мМ гидрокарбоната аммония, содержащего 4.5 нг / мкл трипсина для секвенирования (Promega) и 0,025% Proteasemax (Promega) и инкубируют при 45 ° C в течение 2 часов. Пептиды выделяли экстракцией 15 мкл 1% трифторуксусной кислоты (Applied Biosystems) и хранили при 4 ° C.

MALDI-TOF-MS выполняли на масс-спектрометре Ultraflex I TOF / TOF (Bruker Daltonics), оборудованном азотным лазером и установкой LIFT-MS / MS. Суммарные спектры, состоящие из 200–400 индивидуальных спектров, были получены в режиме отражателя положительных ионов с использованием 5 мг / мл 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Sigma-Aldrich) и 5 ​​мг / мл метилендифосфоновой кислоты (Fluka) в 0.1% трифторуксусная кислота в качестве матрицы. Для обработки данных и управления прибором мы использовали программный пакет Compass v1.4, состоящий из FlexControl v3.4, FlexAnalysis v3.4 и BioTools v3.2. Хранение данных и поиск в базе данных выполнялись с помощью ProteinScape v3.1 (Bruker Daltonics). Белки идентифицировали с помощью масс-фингерпринта пептидов Mascot v2.6.2 (Matrix Science) с использованием транскриптома ядовитой железы в качестве базы данных. Поиск был ограничен пептидами длиной более 10 аминокислот с допуском по массе 75 ppm.Карбамидометилирование цистеина рассматривалось как глобальная модификация, окисление метионина рассматривалось как вариабельная модификация, и допускался один пропущенный сайт расщепления. Только пептиды с Mascot Score> 80 рассматривались для дальнейшего анализа (Таблица S3).

2.4.3 NanoLC-ESI-MS

Мы растворили 10 мкг белка в 25 мкл бикарбоната аммония, содержащего 0,1 ProteasMax. Остатки цистеина восстанавливали 5 мМ DTT в течение 30 минут при 50 ° C и модифицировали 10 мМ йодацетамида в течение 30 минут при 24 ° C.Реакцию гасили избытком цистеина перед добавлением 0,025 нг / мкл трипсина в общем объеме 100 мкл. После инкубации при 37 ° C в течение 16 ч реакцию останавливали добавлением трифторуксусной кислоты до конечной концентрации 1%. Затем образец очищали с помощью C18-ZipTip (Millipore), сушили в вакууме и повторно растворяли в 10 мкл 0,1% трифторуксусной кислоты.

Для анализа 1 мкг образца загружали на 50-см колонку μPAC C18 (Pharma Fluidics) в 0,1% муравьиной кислоте при 35 ° C.Пептиды элюировали 3–44% линейным градиентом ацетонитрила в течение 240 мин с последующей промывкой 72% ацетонитрилом при постоянной скорости потока 300 нл / мин с использованием устройства Thermo Fisher Scientific UltiMate 3000RSLCnano. Элюированные образцы вводили в Orbitrap Eclipse Tribrid MS (Thermo Fisher Scientific) в режиме положительной ионизации через Advion TriVersa NanoMate (Advion BioSciences) с напряжением распыления 1,5 кВ и температурой источника 250 ° C. Используя независимый от данных режим сбора данных, полное сканирование МС проводилось каждые 3 секунды в диапазоне масс m / z 375–1500 с разрешением 120 000 и автоматическим регулированием усиления (AGC), установленным на стандартное с максимальным временем впрыска 50 мс.В каждом цикле наиболее интенсивные ионы (зарядовое состояние 2–7) выше порогового количества ионов в 50 000 отбирались с изолирующим окном 1,6 m / z для столкновительной диссоциации с более высокой энергией (HCD) при нормированной энергии столкновения 30%. Спектры фрагментных ионов получали в линейной ионной ловушке с быстрой скоростью сканирования, нормальным диапазоном масс и максимальным временем инжекции 100 мс. После фрагментации выбранные ионы-предшественники были исключены на 15 с.

Данные были получены с помощью Xcalibur v4.3.73.11. (Thermo Fisher Scientific) и анализировали с помощью Proteome Discoverer v2.4.0.305 (Thermo Fisher Scientific). Mascot v2.6.2 использовался для поиска по базе данных транскриптомов. Допуск по массе ионов-предшественников составлял 10 ч. / Млн. Карбамидометилирование цистеина рассматривалось как глобальная модификация, окисление метионина рассматривалось как вариабельная модификация, и допускался один пропущенный сайт расщепления. Допуск по массе ионов фрагментов был установлен на 0,8 Да для обнаружения с помощью линейной ионной ловушки MS 2 .Уровень ложного обнаружения (FDR) для идентификации пептидов был ограничен 0,01 с использованием базы данных-приманок. Для последующего анализа мы рассматривали только белки с Mascot Score> 30 и по крайней мере два проверенных пептида (Таблица S4). Необработанные необработанные протеомные данные доступны по номерам доступа PRIDE XXX, которые будут добавлены при принятии рукописи XXX.

3. Результаты

3.1 Ядовитая железа и ткань тела

A. bruennichi дают высококачественные библиотеки транскриптомов

Ядовитые железы были выделены у 14 самок A.bruennichi , и яд был извлечен и отложен для протеомного анализа. Ядовитые железы и оставшиеся ткани тела отдельно объединяли, и РНК экстрагировали для анализа РНК-Seq. Полученные библиотеки с парными концами проверяли на количество и качество ДНК. Концентрация библиотеки транскриптомов ядовитой железы составляла 116,26 нг / мкл (размер фрагмента = 387 п.н.), а концентрация оставшейся библиотеки тканей тела составляла 91,47 нг / мкл (размер фрагмента = 363 п.н.). Транскриптом ядовитой железы содержал в общей сложности 133 263 138 парных прочтений с содержанием GC 42.2%, Q20 98,2% и Q30 94,5%. Остающийся транскриптом ткани тела содержал в общей сложности 145 808360 парных считываний с содержанием GC 41,6%, Q20 98,3% и Q30 94,8%. Библиотеки были упорядочены и аннотированы с помощью нашего автоматизированного конвейера.

3.1 Только крупные белки яда

A. bruennichi обнаруживаются с помощью SDS-PAGE и MALDI-TOF-MS

Неочищенный яд, отложенный перед экстракцией РНК, сначала фракционировали с помощью 1D-PAGE. Дорожки, представляющие обе концентрации, показали идентичный рисунок полос после окрашивания, и подавляющее большинство полос белка находились в диапазоне 25–100 кДа, с несколькими более слабыми полосами 15–25 кДа и без заметных полос ниже 15 кДа (рис. 2).Чтобы более подробно охарактеризовать свойства этих белков, образец яда фракционировали с помощью 2D-PAGE. На этапе изоэлектрического фокусирования (pH 3–10) были выявлены белки с диапазоном значений pI, хотя преимущественно сосредоточены около pH 7 (рис. 2). В соответствии с результатами 1D-PAGE, стадия ортогонального SDS-PAGE показала, что большинство пятен представляли белки размером 25 кДа или более, только некоторые из них имели размер в диапазоне 10-25 кДа и почти ни один из них не был ниже 10 кДа (рис. 2).

Рисунок 2: Анализ

A.bruennichi белков яда с помощью PAGE. (а) 1D-PAGE белков яда в двух концентрациях, показывающий идентичные картины полос с большинством белков крупнее 25 кДа. (b) 2D-PAGE, показывающий, что белки охватывают диапазон значений pI, но группируются около pH 7, и подтверждают, что большинство белков имеют размер более 25 кДа.

Мы вырезали 152 пятна из 2D-гелей для анализа MALDI-TOF-MS, 41 из которых совпадали со значительно обогащенными предсказанными кодирующими областями из транскриптома нашей ядовитой железы, а остальные соответствовали неядовым белкам.Из 41 пятна, связанного с ядом, только шесть в конечном итоге были отнесены к классам белков, которые, как известно, присутствуют в других ядах животных (Таблица 1). Последовательности белков яда, идентифицированные в A. bruennichi , очень похожи на токсины, ранее идентифицированные его близким родственником, китайским ткачом A. ventricosus (Duan et al., 2013). Их молекулярные массы упали в диапазоне 28,3–50,5 кДа, а функциональная аннотация показала, что все они принадлежат к суперсемейству богатого цистеином секреторного белка, антигена 5 и патогенетического белка 1 (CAP).

Таблица 1:

Идентификация белков яда A. bruennichi с помощью MALDI-TOF-MS. Среди 152 пятен, вырезанных из 2D-гелей, 41 представлял собой белки, которые были обогащены ядовитыми железами, и шесть из них были подобны ранее идентифицированным компонентам яда, все предполагаемые члены суперсемейства CAP.

3.2 Еще

белков яда A. bruennichi были выявлены с помощью nanoLC-ESI-MS высокого разрешения

В параллельном процессе протеомики неочищенный яд был проанализирован с помощью nanoLC-ESI-MS высокого разрешения (Orbitrap), выявив в общей сложности 1806 групп белков, включая 415 предсказанных кодирующих областей, соответствующих значительно обогащенным предсказанным кодирующим регионам из транскриптома нашей ядовитой железы.Из этого подмножества мы извлекли 54 группы белков с предполагаемыми функциями яда, представляющих 20 различных семейств белков. Многие из этих семейств белков ранее были идентифицированы в ядах пауков, включая ингибиторы сериновой протеазы типа Кунитца, прокинетицин, белки EF-hand, MIT-атракотоксины, астацин-подобные металлопротеиназы и пептиды ICK. Три других показали сходство с гормонами и нейропептидами (белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста (IGFBP), диуретический гормон и ITG-подобные пептиды).Другой класс белков показал высокое сходство последовательностей с не охарактеризованными токсинами, ранее выделенными из A. ventricosus (Duan et al., 2013). Поиски BLAST не выявили каких-либо других подобных последовательностей, поэтому оставшиеся белки были определены как «неидентифицированные аранетоксины». Эксперимент nanoLC-ESI-MS также подтвердил наши данные MALDI-TOF-MS, показав, что яда A. bruennichi содержит несколько белков CAP, которые также являются наиболее распространенными белками среди компонентов яда (таблица 2).

Таблица 2:

Идентификация белков яда A. bruennichi с помощью nanoLC-ESI-MS. Анализ пептидных фрагментов позволил нам идентифицировать группы белков с предполагаемыми функциями яда, представляющие 20 различных семейств белков. Подтверждая параллельный анализ MALDI-TOF-MS, большинство белков можно отнести к суперсемейству CAP.

3.3 Объединение данных показывает, что

яд A. brunnichii нетипичен для пауков

Транскриптомные и протеомные данные были объединены для всестороннего анализа состава яда с точки зрения разнообразия и обилия белков яда.С точки зрения общего разнообразия, суперсемейство CAP было наиболее представительным, с 15 различными белками CAP, составляющими более 27% всех идентифицированных белковых компонентов. Богатые лейцином повторяющиеся белки и неклассифицированные аранетоксины также были хорошо представлены, каждый из пяти членов составлял ~ 9% от общего разнообразия. Мы идентифицировали четыре предполагаемых хитиназы и сериновые протеазы, каждая из которых составляет ~ 7,5% от общего разнообразия, и три ICK и астацин-подобные металлопротеиназы, каждая из которых составляет ~ 5.5% от общего разнообразия. Было два члена семейств MIT-атракотоксинов и ITG-подобных пептидов, каждый из которых вносил ~ 3,5% от общего разнообразия. Наконец, семейства ингибиторов сериновой протеазы Кунитца, цистатин, диуретический гормоноподобный пептид, техилектин, IGFBP, ядовитый белок 11, 5′-нуклеотидаза, прокинетицин, тиреоглобулин, пептидаза S10 и EF-hand были представлены одним членом, каждый из которых вносил вклад <2% к общему разнообразию (рис. 3). По численности CAP представлены 64.3% от общего содержания белка А . bruennichi и были наиболее доминирующим компонентом, за ними следовали ITG-подобные пептиды (9,5%), неклассифицированные аранетоксины (7,7%) и белки с высоким содержанием лейцина (7,7%). Остальные компоненты были экспрессированы на гораздо более низких уровнях: ICK составляли только 3,3% от общего содержания белка, за ними следовали предполагаемые хитиназы (2,6%) и сериновые протеазы (2,7%), а остальные составляли <1% (рис. 3). .

Рисунок 3:

Профиль белка яда A.Бруенничи . (а) Круговые диаграммы отображают состав яда с точки зрения разнообразия белков на основе количества различных предсказанных кодирующих последовательностей по сравнению с изобилием белка на основе количества транскриптов на миллион считываний для каждой кодирующей последовательности. По обоим параметрам белки семейства CAP являются доминирующим компонентом яда с 15 различными членами, многие из которых экспрессируются на высоких уровнях. (b) Молекулярная масса (кДа) идентифицированных белков яда с наименьшей, средней и наибольшей молекулярной массой на группу слева направо.(c) Распределение малых (<20 кДа) и больших (> 20 кДа) белков с точки зрения разнообразия белков и изобилия белков.

В соответствии с экспериментами 1D / 2D-PAGE белки с более высокой молекулярной массой составляли большую часть разнообразия A . Протеом яда bruennichi и также являются наиболее распространенными компонентами. Мы идентифицировали 23 белка / пептида с молекулярной массой <20 кДа, но они составляли только ~ 42% протеомного разнообразия и только ~ 13% от общего содержания белка (рис. 3).

4. Обсуждение

Яды пауков обычно состоят в основном из низкомолекулярных пептидов, причем пептиды ICK являются преобладающими нейротоксическими компонентами. Например, пептиды ICK представляют 93% разнообразия в яде Phoneutria nigriventer (Diniz et al., 2018) и 42 из 46 идентифицированных компонентов яда в баричелиде Trittame loki (Undheim et al., 2013). В Cupiennius salei короткие катионные пептиды и пептиды ICK вместе составляют 39% компонентов яда, тогда как более крупные белки вносят только 15% в его разнообразие (Kuhn-Nentwig et al., 2019). О преобладании пептидов ICK также сообщалось в яде, выделенном из Pardosa pseudoannulata, Cyriopagopus hainanus (ранее Haplopelma hainanum), Selenocosmia jiafu, Lycosa singoriensis и Pamphobeteus. , 2013; Cheng et al., 2016; Huang et al., 2018; Estrada-Gomez et al., 2019; Hu et al., 2019). Общее предположение состоит в том, что пептиды ICK представляют собой очень разнообразные компоненты яда пауков, и десятки различных пептидов могут присутствовать в каждом виде (Langenegger et al., 2019). Напротив, мы обнаружили, что пептиды ICK были лишь второстепенным компонентом яда A. bruennichi , с идентифицированными только тремя различными пептидами ( ~ 5,5% от общего разнообразия) и низкой численностью (только 3,3% от общего содержания на основе по подсчетам TPM), что предполагает менее важную роль в яде пауков-ос по сравнению с другими пауками. Вместо этого мы обнаружили, что белки суперсемейства CAP были как самыми разнообразными (15 различных членов,> 27% от общего разнообразия), так и самыми многочисленными (> 64% от общего содержания на основе подсчета TPM), что позволяет предположить, что эти белки особенно важны. для функции А.bruennichi яд. Учитывая, что яд A. ventricosus также содержит несколько белков CAP (Duan et al., 2013), мы предполагаем, что белки CAP могут иметь важное значение для функции яда пауков, плетущих сферы (хотя мы не можем напрямую сравнивать наши результаты с этим предыдущим исследованием. потому что он был основан исключительно на протеомном анализе и не имел количественных данных). Однако нетипичная природа яда A. bruennichii позволяет нам разработать функциональную гипотезу, основанную на экологии пауков-ос, сосредоточив внимание на наиболее доминирующих компонентах яда.

4.1. Важность белков суперсемейства CAP в яде пауков-ос

Суперсемейство CAP — одна из нескольких групп белков, которые претерпели конвергентное рекрутирование и неофункционализацию в ядовитых системах, поэтому белки CAP были выделены из ядов змей, пауков, конические улитки, скорпионы, рыбы, головоногие моллюски и различные насекомые (Fry et al., 2009). Эта таксономическая повсеместность отражает способность белков CAP принимать разнообразные функции. Например, белки CAP в яде змей действуют как нейротоксины, взаимодействуя с ионными каналами (Brown et al., 1999; Ямазаки и др., 2002; Fry et al., 2009), тогда как белки CAP в яде миног, гематофагов и клещей, как полагают, способствуют питанию (Ribeiro et al., 2004; Ito et al., 2007; Fry et al., 2009). У пчел, ос и муравьев белки CAP являются основными аллергенными компонентами яда и поэтому связаны с воспалением и потенциально фатальной анафилаксией (Fang et al., 1988; Caruso et al., 2016). Белки CAP были обнаружены в ядах нескольких пауков, но, как правило, как второстепенные компоненты, и их функция неизвестна (например,г. Undheim et al., 2013; Kuhn-Nentwig et al., 2019). На данный момент единственными известными пауками, в яде которых преобладают белки CAP, являются A. ventricosus (Duan et al., 2013) и A. bruennichi .

Белки CAP в яде A. bruennichi , как и у других членистоногих, вряд ли будут действовать как нейротоксины, поскольку в них отсутствует C-концевой домен, богатый цистеином, который придает нейротоксичность белков CAP в яде змеи (Fry et al. , 2009). Филогенетические реконструкции показывают, что белки CAP паука сходны с Tex31, хорошо охарактеризованным белком CAP из яда конусной улитки Conus textile (Fry et al., 2009), обладающий протеолитической активностью (Milne et al., 2003). Это говорит о том, что белки САР в яде A. bruennichi (и других ядах пауков) могут поддерживать экстраоральное пищеварение или действовать как факторы распространения, способствующие поглощению других компонентов яда. Отсутствие нейротоксинов суперсемейства CAP у пауков не будет недостатком, потому что яд содержит другие нейротоксические компоненты, включая пептиды ICK, прокинетики и MIT-атракотоксины. Если предположить, что недавно идентифицированные аранетоксины и нейропептиды также действуют как нейротоксины, яд паука осы явно содержит внушительный арсенал биоактивных компонентов, которые могут облегчить охоту.Интересно, что раннее исследование воздействия яда пауков на тараканов и мучных жуков продемонстрировало, что яд паука-осы может парализовать, но не убить обе эти жертвы (Friedel and Nentwig, 1989). Таким образом, несмотря на нетипичный состав яда A. bruennichi , этот вид, тем не менее, способен к нейротоксическому отравлению.

4.2 Яд пауков осы содержит потенциально новые классы токсинов, аналогичные нейропептидам членистоногих

Наш протеомный анализ A.bruennichi идентифицировал пять полипептидов, которые мы сгруппировали как неклассифицированные аранетоксины, демонстрируя высокое сходство последовательностей с недавно обнаруженными аранетоксинами U 6 и U 8 аранетоксинов в A. ventricosus (Duan et al., 2013). Они еще официально не отнесены к какому-либо известному классу токсинов, и их молекулярные и биологические функции еще предстоит определить. Однако пять неклассифицированных аранетоксинов были экспрессированы на высоком уровне в нашем наборе данных транскриптома ядовитых желез и, следовательно, вероятно, будут выполнять важные функции в A.bruennichi Venom System. Их присутствие у двух ткачей сфер, но ни у одного другого семейства пауков, предполагает, что их роль может быть специфической для уникальной экологической ниши ткачей сфер.

Мы также идентифицировали один диуретический гормоноподобный пептид, один IGFBP и два ITG-подобных пептида. Пептиды, подобные диуретическим гормонам, содержат Dh41-подобный домен и связаны с диуретическим гормоном из Флоридского муравья-плотника ( Camponotus floridanus ) и, в меньшей степени, U-scoloptoxin-Sm2a из многоножки Scolopendra morsitans (Unddra morsitans ). al., 2015). Этот класс белков не обнаружен в ядах других пауков. IGFBP A. bruennichi тесно связан с белком, обнаруженным в яде блуждающего паука-тигра Cupiennius salei (Kuhn-Nentwig et al., 2011). Такие белки обычно встречаются в ядах паукообразных, но также и у скорпионов ( Superstitia donensis, Hadrurus spadix и Centruroides hentzi ) и клещей рода Amblyomma (Santibanez-Lopez et al., 2016; Esteves et al., 2016; Esteves et al., 2016; Esteves et al., 2017; Рокита и Уорд, 2017; Ward et al., 2017). Родственный белок присутствует в яде A. ventricosus , но его функция еще не определена (Kono et al., 2019). В то время как диуретический гормоноподобный пептид A. bruennichi и белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста, являются относительно второстепенными компонентами яда, два ITG-подобных пептида экспрессируются на высоких уровнях в транскриптоме ядовитой железы и, следовательно, могут выполнять более важные функции. . Они тесно связаны с пептидами, обнаруженными в совке черной совки ( Agrotis ipsilon ) и C.floridanus , но не были идентифицированы в ядах других пауков.

Роль всех трех классов белков, описанных выше, неясна, но гормоны у других ядовитых животных использовались как токсины для подавления добычи. Такая неофункционализация может происходить, когда гормоны, задействованные в ядовитой железе для нормальной физиологической активности, претерпевают мутации, которые влияют на химию их поверхности и потенциал для функциональных взаимодействий. Например, нейропептид, регулирующий физиологические процессы у хищника, может стать токсином, если мутация заставляет его взаимодействовать с другим рецептором у вида жертвы после заражения.Если этот процесс происходит в контексте дупликации и дивергенции генов, новая роль в отравлении может быть отделена от исходной физиологической роли, позволяя эволюционным силам фиксировать нейропептид как ядовитый токсин. Неофункционализация гормонов и нейропептидов в ядовитых системах дополнительно подтверждается недавним открытием конвергентного рекрутирования гипергликемических гормонов в яд пауков и многоножек (Undheim et al., 2015). Это исследование продемонстрировало, что токсины, происходящие от спиралевидных нейропептидов (HAND), происходят из гормонов семейства ионно-транспортных пептидов / гипергликемических гормонов ракообразных (ITP / CHH), которые являются повсеместными и функционально разнообразными нейропептидами у членистоногих.Пептиды ITP / CHH также были задействованы в ядовитых системах клещей и ос и не ограничиваются семейством HAND. Например, яд изумрудной осы ( Ampulex compressa ) содержит нейропептиды тахикинина и коразонина, которые вызывают гипокинезию у тараканов (Arvidson et al., 2019), тогда как эксендин из яда ящериц-гелодерматид представляет собой модифицированный глюкагоноподобный пептид, который мешает высвобождение инсулина поджелудочной железы (Yap and Misuan, 2019). Амфибии также задействовали различные гормональные пептиды в качестве токсинов кожи (Gaudino et al., 1985; Роелантс и др., 2010; Роелантс и др., 2013; Lüddecke et al., 2018). Новые нейропептиды в A. bruennichi могут выполнять другие функции, и их потенциальная роль в качестве токсинов должна быть проверена, но сильная экспрессия ITG-подобных пептидов указывает на важную функцию в системе яда.

4.3 Потенциальная экологическая роль яда атипичного паука осы

Нетипичный состав яда A. bruennichi можно объяснить трофической специализацией, которая предполагает отбор простых ядов с приоритетом определенных компонентов, необходимых для подчинения выбранных видов добычи.Это будет контрастировать с универсальными хищниками, у которых различные компоненты яда будут давать селективное преимущество (Daltry et al., 1996; Fry et al., 2003; Li et al., 2005; Phuong et al., 2016; Lyons et al., 2020). Однако A. bruennichi не считается специализированной кормушкой, и необходимо искать альтернативное объяснение (Szymkowiak et al., 2005).

В ходе новаторского исследования охотничье поведение трех ткачей сфер ( Nephila claviceps, Argiope aurantia и Argiope argentata ) сравнивалось с использованием жуков-бомбардиров ( Brachinus spp.) в качестве добычи (Eisner and Dean, 1976). Эти жуки развили уникальную химическую защиту, включающую вызванное стрессом высвобождение фенольных соединений из брюшных желез под высоким давлением. Фенольные соединения подвергаются быстрому экзотермическому окислению до бензохинонов, таким образом опрыскивая хищников разрядом под давлением при температурах до 100 ° C, что позволяет жуку ускользать из большинства ситуаций (Dean et al., 1990). Когда таких жуков предлагали трем паукам, взаимодействия были отчетливыми: с.ш.claviceps всегда пытался ввести яд в качестве первой стратегии атаки, и это приводило к успешной защите и побегу жуков, тогда как оба вида Argiope использовали шелк в качестве первой стратегии атаки, и отравление последует только тогда, когда жук будет полностью покрыт и не сможет двигаться (Eisner and Dean, 1976). В другом исследовании с использованием A. bruennichi в качестве модельного хищника шелк был использован для подавления большинства насекомых-жертв, в том числе с другими надежными защитными системами, такими как осы, и только жертвы чешуекрылых были атакованы ядом первыми (Nyffeler and Benz, 1982). .Аналогичные результаты были получены для восьми других видов Argiope , что свидетельствует о высокой сохранности этого специализированного охотничьего поведения в пределах рода (Robinson, 1969; Harwood, 1974; Nyffeler and Benz, 1982). Распространенность этой охотничьей стратегии на основе шелка может помочь объяснить простоту его яда, который отбирался исключительно из-за его способности подчинять добычу чешуекрылых.

У ядовитых животных каждый токсин является ценным ресурсом, который способствует приспособленности, облегчая хищничество, но это преимущество должно быть сбалансировано с метаболическими затратами на пополнение запасов яда (Nisani et al., 2012; Saggiomo et al., 2017; Blennerhassett et al., 2019). Многие ядовитые животные превратились в специалистов по трофике, чтобы сократить эти затраты, а некоторые даже производят разные яды для разных целей (например, Walker et al., 2018). Пауки сталкиваются с подобной дилеммой, потому что они обладают двумя потенциально конкурирующими системами подчинения добычи, а именно их ядом и шелковыми железами. В обоих случаях ресурсы белка используются как средство облегчения хищничества, и в обоих случаях железы должны восполняться за счет значительных метаболических затрат (Guehrs et al., 2008). Мы предполагаем, что простота яда A. bruennichi может отражать эволюционные последствия конкуренции за ресурсы между системами яда и шелка, которые привели его поведенческую специализацию к использованию различных стратегий против различных видов добычи. Любопытно, что стратегия «сначала шелк» обеспечивает пауку-осу конкурентное преимущество в виде высокой вероятности успеха даже против хорошо защищенной добычи (Eisner and Dean, 1976; Nyffeler and Benz, 1982), потенциально способствуя беспрецедентному успеху во время недавнего ареала. расширение (Krehenwinkel, Tautz, 2013; Krehenwinkel et al., 2015).

5. Выводы и перспективы на будущее

Наш подробный анализ яда A. bruennichi выявил потенциальные новые классы токсинов и потенциальные новые роли для известных семейств белков, включая преобладающее суперсемейство CAP. Молекулярные функции и биологические роли этих белков должны быть подробно исследованы, чтобы разобраться в биологии яда пауков-ос и выявить новые источники лекарств. Идентифицированные нами последовательности могут быть использованы для получения рекомбинантного A.bruennichi в больших количествах для детального функционального анализа, и эта работа уже ведется в нашей лаборатории. Однако пауки-осы — это маленькие животные с ограниченным выходом яда, поэтому они не подходят для традиционных рабочих процессов фракционирования (например, von Reumomont et al., 2014; von Reumont, 2018). Наш рабочий процесс веномики преодолевает эту проблему, комбинируя выборку интересных кандидатов на основе данных на основе анализа транскриптома ядовитой железы со стратегией двойной протеомики для комплексной идентификации белков яда напрямую.Важно отметить, что наш высокочувствительный рабочий процесс с ядом означает, что полный состав яда возможен, начиная всего с 14 пауков. Подобный подход недавно был использован для анализа протеома яда пауков семейства Pholcidae (Zobel-Thropp et al., 2019).

Такие новые рабочие процессы и технические платформы помогут расширить наши знания о составе яда за пределы небольшой коллекции поддающихся лечению организмов с легкодоступными системами яда. Это уже показало, что многие общепринятые предположения о яде (основанные на ограниченном числе исследованных видов) не подтверждаются при включении более разнообразных видов.Мы описываем яд A. bruennichi как нетипичный для пауков, поскольку его состав, в котором преобладают белки суперсемейства CAP и пептиды ICK, выполняющие второстепенную роль, отличается от ограниченного диапазона ядов пауков, которые были исследованы до сих пор. Точно так же недавний протеомный анализ яда фолцид также выявил отчетливый состав, в котором преобладают металлопротеазы неприлизина (Zobel-Thropp et al., 2019). Оба исследования подчеркивают важность заполнения таксономических пробелов в исследованиях ядов, чтобы полностью понять скрытое молекулярное разнообразие.Это, вероятно, покажет, что нет «типичного» паучьего яда, это скорее спектр составов, отражающих различные экологические ниши. Такое разнообразие не только осветит область эволюционной биологии паукообразных, но и предоставит гораздо больше многообещающих кандидатов для трансляционных исследований.

6. Вклад авторов

TL, SL, AB, BMvR и AV разработали исследование. TL провела полевые исследования и сгенерировала образец материала для секвенирования транскриптома и протеомики яда.TL, SL и TT выполняли лабораторные протеомические исследования. TT и GL генерировали и анализировали масс-спектры. TL, FF, BMvR и AB сгенерировали и проанализировали наборы данных транскриптомов. AV привлекла финансирование для исследования. TL, BMvR SL написали рукопись при существенном участии AB, FF, GL, TT и AV.

6. Благодарности

Авторы благодарны Филиппу Хейзе, Леа Талманн и Анне Паас за их поддержку в полевых и лабораторных работах. Авторы выражают признательность Министерству высшего образования, исследований и искусств (HMWK) земли Гессен за щедрое финансирование проекта «Яд животных» через Центр LOEWE «Трансляционная геномика биоразнообразия».

Биомолекул | Бесплатный полнотекстовый | Экономическая дилемма между системами молекулярного оружия может объяснить арахно-атипичный яд у пауков-ос (Argiope bruennichi)

1. Введение

Пауки — разнообразные и богатые видами членистоногие, покорившие большинство наземных местообитаний. 48 463 ныне существующих видов пауков [1] имеют общий план тела, который мало изменился за ~ 380 миллионов лет эволюции. Пауки также обладают уникальным биохимическим набором инструментов, который использует комбинацию яда и шелка для подчинения добычи, что способствует их эволюционному успеху [2].Более того, они представляют собой один из немногих отрядов наземных животных, у которых почти все современные виды обладают функциональной системой яда и, таким образом, считаются наиболее успешной группой ядовитых животных [3]. Соответственно, пауки играют ключевую экологическую роль в качестве ядовитых хищников, поддерживая равновесие популяций насекомых [4]. Яды представляют собой сложные смеси низкомолекулярных соединений, пептидов и белков, которые действуют как токсины, нарушая важные физиологические процессы при попадании в организм человека. добыча [5,6].Они используются для защиты, нападения или сдерживания конкурентов, но во всех случаях это физиологически дорогие черты, которые были оптимизированы сильным давлением отбора для выполнения определенных функций. Эта эволюционная оптимизация часто приводит к высокой селективности и целевой биоактивности, а это означает, что яды животных теперь считаются ценными биоресурсами в области открытия лекарств [7]. Некоторые лекарственные препараты-блокбастеры были получены из компонентов яда [7], но они также были исследованы в качестве исследовательских инструментов, косметики, промышленных ферментов или биоинсектицидов [8,9,10,11].Яды пауков имеют тенденцию быть химически более сложными, чем яды других животных, и у одного вида может присутствовать до 3000 различных компонентов яда [12,13]. Было подсчитано, что сумма всех ядов пауков может в конечном итоге дать 10 миллионов биоактивных молекул, но к настоящему времени обнаружено только 0,02% этого разнообразия [14,15]. В ядах пауков было обнаружено несколько многообещающих лекарств-кандидатов от инсульта, боли, рака и нервных расстройств [16,17,18,19]. Основными компонентами этих ядов пауков являются пептиды низкомолекулярного ингибитора цистеинового узла (ICK) с надежными третичными структурами, обусловленными наличием мотива псевдоязычных переплетенных дисульфидных связей [13,20,21].Кроме того, такие пептиды, описываемые как узелтины, часто нейротоксичны и чрезвычайно устойчивы к нагреванию, осмотическому стрессу и ферментативному перевариванию, что делает их идеальными кандидатами в лекарственные препараты [13]. Хотя пептиды ICK обнаружены в ядах других членистоногих [22,23,24,25], разнообразие этих пептидов в ядах пауков беспрецедентно. Примерно 60% всех компонентов яда пауков, доступных в UniProt [26], являются пептидами ICK; следовательно, эти пептиды обычно считаются основным компонентом ядов пауков [13].Раньше анализ ядов основывался на методах фракционирования, которые требовали больших количеств исходного материала [27,28]. Таким образом, предыдущие исследования ядов пауков были сосредоточены на видах с сильными антропоцентрическими связями, например, на тех, которые представляют прямую медицинскую угрозу или имеют необычайные размеры, что делает яд более доступным в достаточных количествах. Этот анализ ограничивался членами семейств Atracidae, Ctenidae, Theraphosidae, Sicariidae и Theridiidae, которые представляют собой узкую выборку разнообразия пауков [1,15].Совсем недавно появление высокопроизводительных методов, совместимых с крошечными образцами, предоставило средства для расширения области таких исследований с менее доступных видов [12,29]. Комбинации геномики, транскриптомики, протеомики и микробиомики [30,31] теперь позволяют анализировать яды из ранее забытых таксонов [32] в развивающейся области, известной как современная эволюционная ядовитость [29]. вообще не изучался в контексте ядовитых систем [15,33].Таким образом, в данном исследовании мы рассмотрели семейство Araneidae (ткачи сфер), которое является третьим по величине семейством пауков, включающим 3078 ныне существующих видов [1]. Ткачи сфер строят заметные и часто большие орбоподобные сети для кормления, привлекая интерес эволюционных биологов [34,35]. Об их ядах известно немного, и только один вид (китайский кругопряд Araneus ventricosus) был исследован с использованием ядовитого подхода [36]. Мы выбрали осу-паука Argiope bruennichi, который имеет осиноподобный узор полос, который, возможно, превратился в инструмент для приманки добычи [37].Этот вид используется в качестве модельного организма для исследования полового диморфизма, химической экологии, репродуктивного поведения, анализа микробиома и расширения ареала, связанного с изменением климата [38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 ]. Его яд был извлечен для анализа биологической активности, но не был подробно проанализирован [27]. Мы применили передовой рабочий процесс протеотранскриптомики, в котором автоматизированная стратегия множественной сборки использовалась в качестве первого шага для идентификации и аннотирования транскриптов, специфичных для ядовитых желез.Они были сопоставлены с протеомными компонентами, обнаруженными непосредственно с использованием двух параллельных масс-спектрометрических (МС) платформ для достижения исчерпывающего и чувствительного обнаружения и идентификации белков. Мы обсуждаем функциональные компоненты яда в контексте охотничьего поведения на осовых пауков, при котором шелк, а не ядовитый укус, является основным оружием, используемым для подавления добычи [48].

4. Обсуждение

Яды пауков обычно состоят в основном из низкомолекулярных пептидов, причем пептиды ICK являются преобладающими нейротоксическими компонентами.Например, пептиды ICK представляют 93% разнообразия в яде Phoneutria nigriventer [65] и 42 из 46 идентифицированных компонентов яда в барихелидном Trittame loki [66]. У Cupiennius salei короткие катионные пептиды и пептиды ICK вместе составляют 39% компонентов яда, тогда как более крупные белки вносят лишь 15% в его разнообразие [67]. О преобладании пептидов ICK также сообщалось в яде, выделенном из Cyriopagopus hainanus (ранее Haplopelma hainanum), Selenocosmia jiafu, Lycosa singoriensis и Pamphobeteus verdolaga [68,69,70,71].Общее предположение состоит в том, что пептиды ICK являются очень разнообразными компонентами яда пауков, и у каждого вида могут присутствовать десятки различных пептидов [13]. Напротив, мы обнаружили, что пептиды ICK были лишь второстепенным компонентом яда A. bruennichi, с идентифицированными только тремя различными пептидами (~ 5,5% от общего разнообразия) и низкой численностью (только 3,3% от общего содержания на основе TPM). подсчитывает), что предполагает менее важную роль в яде пауков-ос по сравнению с другими пауками. Вместо этого мы обнаружили, что белки суперсемейства CAP были как самыми разнообразными (15 различных членов,> 27% от общего разнообразия), так и самыми многочисленными (> 64% от общего содержания на основе подсчета TPM), что позволяет предположить, что эти белки особенно важны. для функции А.яд бруенничи. Учитывая, что яд A. ventricosus также содержит несколько белков САР (на долю которых приходится 22,6% яда) (рис. 5) [36], мы предполагаем, что белки САР могут иметь важное значение для функций яда пауков, плетущих орбиты. К сожалению, мы не можем напрямую сравнить наши результаты с этим предыдущим исследованием, потому что оно было основано исключительно на протеомном анализе и не имело количественных данных. Это, в частности, важно, поскольку простота яда A. bruennichi была восстановлена ​​с помощью нашего протеотранскриптомического подхода на уровне изобилия белка (количественно в TPM) (рис. 4).Степень, в которой наши результаты, касающиеся яда пауков-ос, могут быть обобщены для Araneidae, должна стать предметом будущих исследований. Однако нетипичная природа яда A. bruennichi позволяет нам разработать функциональную гипотезу, основанную на экологии пауков-ос, сосредоточив внимание на наиболее доминирующих компонентах яда.
4.1. Важность белков суперсемейства CAP в яде пауков осы
Суперсемейство CAP является одной из нескольких групп белков, которые претерпели конвергентное рекрутирование и неофункционализацию в ядовитых системах, поэтому белки CAP были выделены из ядов змей, пауков, шишек, скорпионов. , рыбы, головоногие моллюски и различные насекомые [5].Эта таксономическая повсеместность отражает способность белков CAP принимать разнообразные функции. Например, белки CAP в ядах змей действуют как нейротоксины, взаимодействуя с ионными каналами [5,72,73], тогда как белки CAP в ядах миног, гематофагов и клещей, как полагают, способствуют питанию [5,74,75]. У пчел, ос и муравьев белки CAP являются основными аллергенными компонентами яда и поэтому связаны с воспалением и потенциально смертельной анафилаксией [76,77]. Белки CAP были обнаружены в ядах нескольких пауков, но, как правило, как второстепенные компоненты, и их функция неизвестна [66,67].На сегодняшний день единственным известным пауком, в яде которого преобладают белки CAP, является A. bruennichi. Белки CAP в яде A. bruennichi, как и у других членистоногих, вряд ли будут действовать как нейротоксины, поскольку у них отсутствует C-концевой домен, богатый цистеином, который придает нейротоксичность белков CAP в яде змеи [5]. Филогенетические реконструкции показывают, что белки CAP пауков сходны с Tex31, хорошо охарактеризованным белком CAP из яда ткани Conus конусной улитки [5], который обладает протеолитической активностью [78].Это говорит о том, что белки CAP в яде A. bruennichi (и других ядах пауков) могут способствовать экстраоральному пищеварению, созреванию токсина или действовать как факторы распространения, способствующие поглощению других компонентов яда. Отсутствие нейротоксинов суперсемейства CAP у пауков не будет недостатком, поскольку яд содержит другие нейротоксические компоненты, включая пептиды ICK, прокинетики и MIT-атракотоксины. Если предположить, что недавно идентифицированные аранетоксины и нейропептиды также действуют как нейротоксины, яд паука осы явно содержит внушительный арсенал биоактивных компонентов, которые могут облегчить охоту.Интересно, что раннее исследование воздействия яда пауков на тараканов и мучных жуков продемонстрировало, что яд паука осы может парализовать, но не убить обе эти жертвы [27]. Таким образом, несмотря на нетипичный состав яда A. bruennichi, этот вид все же способен к нейротоксическому отравлению.
4.2. Яд паука осы содержит потенциально новые классы токсинов, аналогичные нейропептидам членистоногих
Наш протеомный анализ яда A. bruennichi выявил пять полипептидов, которые мы сгруппировали как неклассифицированные аранетоксины, демонстрируя высокое сходство последовательностей с недавно обнаруженными аранетоксинами U 6 и U 8 в.ventricosus [36]. Они еще официально не отнесены к какому-либо известному классу токсинов, и их молекулярные и биологические функции еще предстоит определить. Однако пять неклассифицированных аранетоксинов были экспрессированы на высоких уровнях в нашем наборе данных транскриптома ядовитых желез и, следовательно, вероятно, будут выполнять важные функции в системе яда A. bruennichi. Их присутствие у двух ткачей сфер, но ни у одного другого семейства пауков, предполагает, что их роль может быть специфической для уникальной экологической ниши ткачей сфер.Мы также идентифицировали один диуретический гормоноподобный пептид, один IGFBP и два ITG-подобных пептида. Пептиды, подобные диуретическим гормонам, содержат Dh41-подобный домен и связаны с диуретическим гормоном из Флоридского муравья-плотника (Camponotus floridanus) и, в меньшей степени, с U-сколоптоксином-Sm2a из многоножки Scolopendra morsitans [79]. Этот класс белков не обнаружен в ядах других пауков. IGFBP A. bruennichi тесно связан с белком, обнаруженным в яде блуждающего паука-тигра Cupiennius salei [80].Такие белки обычно обнаруживаются в ядах паукообразных, но также и у скорпионов (Superstitia donensis, Hadrurus spadix и Centruroides hentzi) и клещей рода Amblyomma [81,82,83,84]. Родственный белок кодируется в геноме A. ventricosus, но его функция еще не определена [85]. В то время как диуретический гормоноподобный пептид A. bruennichi и белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста, являются относительно второстепенными компонентами яда, два ITG-подобных пептида экспрессируются на высоких уровнях в транскриптоме ядовитой железы и, следовательно, могут выполнять более важные функции.Они тесно связаны с пептидами, обнаруженными в черной совке-совке (Agrotis ipsilon) и C. floridanus, но не были обнаружены в ядах других пауков. Роль всех трех классов белков, описанных выше, неясна, но гормоны у других ядовитых животных использовались как токсины для подавления добычи. Такая неофункционализация может происходить, когда гормоны, задействованные в ядовитой железе для нормальной физиологической активности, претерпевают мутации, которые влияют на химию их поверхности и потенциал для функциональных взаимодействий.Например, нейропептид, регулирующий физиологические процессы у хищника, может стать токсином, если мутация заставляет его взаимодействовать с другим рецептором у вида жертвы после заражения. Если этот процесс происходит в контексте дупликации и дивергенции генов, новая роль в отравлении может быть отделена от исходной физиологической роли, позволяя эволюционным силам фиксировать нейропептид как ядовитый токсин. Неофункционализация гормонов и нейропептидов в ядовитых системах дополнительно подтверждается недавним открытием конвергентного рекрутирования гипергликемических гормонов в яд пауков и многоножек [79].Это исследование продемонстрировало, что токсины, происходящие от спиральных членистоногих и нейропептидов (HAND), происходят из гормонов семейства ионно-транспортных пептидов / гипергликемических гормонов ракообразных (ITP / CHH), которые являются повсеместными и функционально разнообразными нейропептидами у членистоногих. Пептиды ITP / CHH также были задействованы в ядовитых системах клещей и ос и не ограничиваются семейством HAND. Например, яд изумрудной осы (Ampulex compressa) содержит нейропептиды тахикинина и коразонина, которые вызывают гипокинезию у тараканов [86], тогда как эксендин из яда ящериц-гелодерматид представляет собой модифицированный глюкагоноподобный пептид, который препятствует высвобождению инсулина поджелудочной железы [87].Амфибии также задействовали различные гормональные пептиды в качестве токсинов кожи [88,89,90,91]. Новые нейропептиды в A. bruennichi могут выполнять другие функции, и их потенциальная роль в качестве токсинов должна быть проверена, но сильная экспрессия ITG-подобных пептидов указывает на важную функцию в системе яда.
4.3. Потенциальная экологическая роль яда атипичного паука осы
Нетипичный состав яда A. bruennichi можно объяснить трофической специализацией, которая предполагает отбор простых ядов с упором на определенные компоненты, необходимые для подчинения избранных видов добычи.Это будет контрастировать с универсальными хищниками, у которых различные компоненты яда будут давать селективное преимущество [92,93,94,95,96]. Однако A. bruennichi не считается специалистом по кормлению, и необходимо искать альтернативное объяснение [97]. В новаторском исследовании охотничье поведение трех ткачей сфер (Nephila claviceps, Argiope aurantia и Argiope argentata) сравнивалось с использованием метода бомбардировщика. жуки (Brachinus spp.) в качестве добычи [48]. Эти жуки развили уникальную химическую защиту, включающую вызванное стрессом высвобождение фенольных соединений из брюшных желез под высоким давлением.Фенольные соединения подвергаются быстрому экзотермическому окислению до бензохинонов, опрыскивая хищников разрядом под давлением при температурах до 100 ° C, что позволяет жуку уйти из большинства ситуаций [98]. Когда таких жуков предлагали трем паукам, взаимодействия были различны: N. claviceps всегда пытался ввести яд в качестве стратегии первой атаки, и это приводило к успешной защите и побегу жуков, тогда как оба вида Argiope использовали шелк в качестве стратегия первой атаки, и отравление последует только тогда, когда жук будет полностью укрыт и не сможет двигаться [48].В другом исследовании с использованием A. bruennichi в качестве модельного хищника шелк использовался, чтобы одолеть большинство насекомых-жертв, включая насекомых с другими надежными защитными системами, такими как осы, и только жертвы чешуекрылых были атакованы ядом первыми [99]. Подобные результаты были получены для восьми других видов Argiope, что позволяет предположить, что это специализированное охотничье поведение высоко консервативно в пределах рода [99,100,101]. Распространенность этой охотничьей стратегии на основе шелка может помочь объяснить простоту его яда, который отбирался исключительно из-за его способности подчинять добычу чешуекрылых.У ядовитых животных каждый токсин является ценным ресурсом, который способствует его приспособленности, облегчая хищничество, но это преимущество должно быть сбалансировано с метаболическими затратами на пополнение запасов яда [102,103,104]. Многие ядовитые животные превратились в специалистов по трофике, чтобы сократить эти затраты, а некоторые даже производят разные яды для разных целей [105]. Пауки сталкиваются с подобной дилеммой, потому что они обладают двумя потенциально конкурирующими системами подчинения добычи, а именно их ядом и шелковыми железами.В обоих случаях белковые ресурсы используются как средство облегчения хищничества, и в обоих случаях пополнение желез должно сопровождаться значительными метаболическими затратами [106]. Мы предполагаем, что простота яда A. bruennichi может отражать эволюционные последствия конкуренции за ресурсы между системами яда и шелка, которые привели его поведенческую специализацию к использованию различных стратегий против различных видов добычи. Интересно, что стратегия «сначала шелк» обеспечивает пауку-осу конкурентное преимущество в виде высокой вероятности успеха даже против хорошо защищенной добычи [48,99], потенциально способствуя беспрецедентному успеху во время недавнего расширения ареала [42,43] .

5. Выводы

Наш подробный анализ яда A. bruennichi выявил потенциальные новые классы токсинов и потенциальные новые роли для известных семейств белков, включая преобладающее суперсемейство CAP. Сравнение с ядом A. ventricosus также показало, что другие пауки-араниды содержат много белков CAP в своем яде, и, таким образом, эти белки могут представлять собой групповые ключевые компоненты для ядов ткачей круговоротов. Молекулярные функции и биологические роли этих белков должны быть детально исследованы, чтобы разобраться в биологии яда пауков-ос и их родственников, а также выявить новые источники лекарств.Идентифицированные последовательности могут быть использованы для производства рекомбинантных белков яда A. bruennichi в больших количествах для детального функционального анализа, и эта работа уже ведется в нашей лаборатории. Однако пауки-осы — это маленькие животные с ограниченным выходом яда, поэтому они не подходят для традиционных рабочих процессов фракционирования [29,32]. Наш рабочий процесс веномики преодолевает эту проблему, комбинируя выборку интересных кандидатов на основе данных на основе анализа транскриптома ядовитой железы со стратегией двойной протеомики для комплексной идентификации белков яда напрямую.Важно отметить, что наш высокочувствительный рабочий процесс с ядом означает, что полный состав яда возможен, начиная всего с 14 пауков. Подобный подход был недавно использован для анализа протеома яда пауков семейства Pholcidae [107]. Такие новые рабочие процессы и технические платформы помогут расширить наши знания о составах ядов за пределы небольшой коллекции поддающихся лечению организмов с легкодоступными системами ядов. Это уже показало, что многие общепринятые предположения о яде (основанные на ограниченном числе исследованных видов) не подтверждаются при включении более разнообразных видов.Мы описываем яд A. bruennichi как нетипичный для пауков, потому что его состав, в котором преобладают белки суперсемейства CAP и пептиды ICK, выполняющие второстепенную роль, отличается от ограниченного диапазона ядов пауков, которые были исследованы до сих пор. Аналогичным образом, недавний протеомный анализ яда фолцид также выявил отчетливый состав, в котором преобладают металлопротеиназы неприлизина [107]. Оба исследования подчеркивают важность заполнения таксономических пробелов в исследованиях ядов, чтобы полностью понять скрытое молекулярное разнообразие.Это, вероятно, покажет, что это не «типичный» паучий яд, а, скорее, спектр составов, отражающих различные экологические ниши. Такое разнообразие не только осветит область эволюционной биологии паукообразных, но и предоставит гораздо больше многообещающих кандидатов для трансляционных исследований.

Рекомбинантные минималистичные шелковые белки, обертывающие пауков, способные к образованию нативных волокон

Abstract

Шелк пауков — желательный биоматериал, характеризующийся высокой прочностью на разрыв, эластичностью и биосовместимостью.Пауки производят разные типы шелка для разных целей, хотя шелка драглайнов были в центре внимания предыдущих исследований. Шелк для обертывания пауков, сделанный из ациниформного протеина (AcSp1), имеет высокую прочность благодаря сочетанию высокой эластичности и прочности на разрыв. AcSp1 в Argiope trifasciata содержит мотив последовательности из 200 аминокислот, который повторяется по меньшей мере 14 раз. Здесь мы продуцировали рекомбинантных белков E. coli , состоящих только из одного-четырех из 200-аминокислотных повторов AcSp1, обозначенных W 1 — W 4 .Мы наблюдали, что очищенные белки W 2 , W 3 и W 4 могут быть индуцированы с образованием шелкоподобных волокон за счет сил сдвига в физиологическом буфере. Волокна, образованные из W 4 , имели диаметр ~ 3,4 мкм и длину до 10 см. Они показали средний предел прочности при растяжении 115 МПа, эластичность 37% и ударную вязкость 34 Дж · см −3 . Белок меньшего размера W 2 образовывал меньше волокон и требовал более высокой концентрации белка для образования волокон, тогда как наименьший белок W 1 не образовывал шелковых волокон, что указывает на то, что требуется минимум два из 200-а.о. повторов. для образования волокон.Микроскопические исследования выявили структурные особенности, указывающие на сборку белков в сферические структуры, фибриллы и шелкоподобные волокна. КД и спектральный анализ комбинационного рассеяния вторичных структур белков предположили переход от преимущественно α-спирального в растворе к все более β-листам в волокнах.

Образец цитирования: Xu L, Rainey JK, Meng Q, Liu X-Q (2012) Рекомбинантные минималистичные белки шелка для обертывания пауков, способные к образованию нативных волокон. PLoS ONE 7 (11): e50227.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0050227

Редактор: Анна Митраки, Университет Крита, Греция

Поступила: 21.06.2012; Одобрена: 22 октября 2012 г .; Опубликовано: 28 ноября 2012 г.

Авторские права: © 2012 Xu et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Канадских институтов исследований в области здравоохранения (http://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html) и Национального совета по научным и инженерным исследованиям Канады. (http://www.nserc-crsng.gc.ca/index_eng.asp) в XQL, Национальный совет по научным и инженерным исследованиям Канады, грант на открытие (http://www.nserc-crsng.gc.ca/index_eng.asp ) JKR, исследовательские гранты QM от Национальной программы исследований и разработок высоких технологий 863 (NO 2006AA03Z451) (http: // www.most.gov.cn/eng/programmes1/200610/t20061009_36225.htm), Национальный фонд естественных наук Китая (№ 31070698) (http://www.nsfc.gov.cn/e_nsfc/desktop/zn/0101.htm ) и ключевые проекты фундаментальных исследований Шанхая (№ 10JC1400300). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Шелк пауков является многообещающим биоматериалом с множеством потенциальных применений в медицине, материаловедении и других областях из-за их исключительно высокой прочности на разрыв, эластичности и прочности.Например, шелк драглайна может показывать прочность, превосходящую даже самые прочные синтетические волокна, включая нейлон, кевлар и высокопрочную сталь [1]. Шелк паука, поскольку он сделан из белка, также является биосовместимым и биоразлагаемым. Эти особенности делают шелк паука очень востребованным для медицинских применений, таких как тканевая инженерия и доставка лекарств. Например, волокна паучьего шелка были описаны как многообещающие биоматериалы для создания биосовместимых искусственных нервных проводников [2] и для улучшения регенерации кожи [3].Прежде чем такое потенциальное использование может быть полностью реализовано, необходимы эффективные средства производства и функционального применения паучьего шелка, что может быть достигнуто за счет лучшего понимания белков паучьего шелка и механизмов образования шелковых волокон.

Производство паучьего шелка из рекомбинантных белков более предпочтительно, чем получение его из пауков. В частности, пауки каннибалисты, и поэтому их нельзя выращивать как шелкопряда. Кроме того, использование рекомбинантных белков позволяет вносить желаемые модификации с помощью генной инженерии и других средств.Однако полноразмерные белки шелка пауков чрезвычайно трудно продуцировать в микроорганизмах из-за их больших размеров и очень повторяющихся аминокислотных последовательностей. Эта трудность объясняется такими факторами, как генетическая нестабильность, истощение тРНК и вторичная структура мРНК [4]. Escherichia coli ( E. coli ) является предпочтительной недорогой клеткой-хозяином для производства белка, но было показано, что она способна продуцировать небольшие фрагменты белков паучьего шелка с относительно высокими выходами.Некоторый прогресс был достигнут в преодолении этой трудности за счет оптимизации кодонов и использования различных систем экспрессии белков. Недавно в модифицированном штамме E. coli был экспрессирован белок шелка нативного размера (284,9 кДа), хотя уровень экспрессии был относительно низким [5]. Некоторые эукариотические системы, включая дрожжи, растения и культивируемые клетки насекомых или млекопитающих, также могут быть использованы для экспрессии рекомбинантных белков паучьего шелка [6], [7], [8], [9]; однако экспрессия белка в этих системах обычно ограничивается низким выходом и / или высокой стоимостью.

Лучшее понимание механизмов образования шелковых волокон также необходимо для производства полезных шелкоподобных волокон из рекомбинантных белков шелка паука. Небольшие фрагменты белков паучьего шелка обычно не могут образовывать шелкоподобные волокна, хотя некоторые из них, как наблюдали, образуют микроскопические фибриллы [10], [11], [12], [13], [14]. Относительно большой фрагмент (60–140 кДа) белка шелка драглайна, который продуцировался в культивируемых клетках млекопитающих, можно было спрядить в шелкоподобные волокна [15].Совсем недавно белок шелка драглайна естественного размера (284,9 кДа) был произведен в E. coli и спряден в шелкоподобные волокна с высокой прочностью [5]. Однако более крупные белки шелка труднее производить с высоким выходом и низкой стоимостью, а в процессе прядения обычно используются органические растворители, и он менее пригоден для изучения молекулярных механизмов образования волокон. Интересно, что относительно небольшой фрагмент (4RepCT, 23,8 кДа) белка шелка драглайна Euprosthenops australis , как было обнаружено, самособирается в физиологическом буфере с образованием шелкоподобных волокон [16], что обеспечивает уникальную систему для изучения механизмов формирования шелка.В частности, было обнаружено, что С-концевой консервативный неповторяющийся домен белка шелка драглайна играет несколько важных ролей в формировании шелка, включая переключение белка шелка на формы сборки и выравнивание определенных структурных элементов повторяющихся основных доменов шелка. белок [17], [18]. Были выдвинуты две конкурирующие модели образования шелковых волокон: одна требует образования жидкокристаллической фазы (теория «жидких кристаллов»), а другая предполагает образование белковых мицелл или сфер [19].

Spiders может производить шесть типов шелковых волокон, которые сильно различаются по физическим свойствам и содержанию белка [20], [21], [22]. Предыдущие исследования в основном были сосредоточены на шелке драглайна из-за его высокой прочности на разрыв. Шелк паука был разделен на три основные группы в зависимости от свойств составляющих его белковых последовательностей [23]. Наиболее часто изучаемая группа представлена ​​шелком драглайнов, белки которого (MaSp1 и MaSp2) характеризуются наличием небольших мотивов последовательностей, которые повторяются сотни и более раз.Эти небольшие мотивы включают полиаланины, которые, как полагают, образуют кристаллиты β-пластин, ответственные за высокую прочность волокна на разрыв, в дополнение к мотивам GGX и GPGXX [1]. Другая группа представлена ​​жгутиковидным шелком, имеющим самую высокую эластичность среди паутинных шелков. Его белковая последовательность содержит небольшие повторяющиеся мотивы GGX, GPGGX и GPGGAGGPY, но лишена полиаланинового мотива [24]. Третью отличительную группу представляет шёлк для обертывания паука (шёлк с острыми углами). Его белковая последовательность содержит повторяющиеся домены, которые намного больше и очень однородны и лишены небольших мотивов последовательностей драглайнов и белков жгутикового шелка [25].Эти большие различия в первичной структуре, вероятно, будут иметь сильное влияние на различные физические свойства каждого паучьего шелка и могут привести к различным структурным и механистическим особенностям образования шелка. Следовательно, важно изучить и сравнить различные группы белков шелка паука.

Шелк для обертывания паука, также известный как шёлк с акциниформой, обладает наивысшей прочностью среди шёлка паука и известен своей способностью безупречно поглощать энергию благодаря сочетанию высокой прочности на разрыв и высокой эластичности (растяжимости) [25].Пауки используют обертывающий шелк, чтобы оборачивать и обездвиживать добычу, а также строить паутину из сперматозоидов и украшения паутины. Оберточный шелк Argiope trifasciata оказался примерно на 50% жестче, чем даже шелк драглайна. Его белок, называемый AcSp1, продуцируется ациниформной железой и, по прогнозам, имеет размер не менее 280 кДа [25]. Последовательность белка AcSp1, которая была предсказана на основе неполной последовательности гена, содержит большой сердцевинный домен, который состоит из повторяющихся последовательностей, и небольшой С-концевой домен, который не повторяется и сохраняется среди различных белков паучьего шелка.Неизвестно, содержит ли AcSp1 консервативный N-концевой неповторяющийся домен, обнаруженный в других белках шелка пауков, поскольку эта часть последовательности гена AcSp1 не была определена. Большой сердцевинный домен содержит 200-аминокислотный повтор, который повторяется не менее 14 раз и является очень однородным. Повторение AcSp1 из 200 аминокислотных остатков сильно отличается от повторов других белков паучьего шелка по размеру и последовательности. Например, 200-аминокислотный повтор имеет более низкое содержание (∼25%) Gly и Ala по сравнению с белками шелка драглайна и белком жгутикового шелка, которые обычно имеют содержание Gly и Ala ∼ 55% и ∼52%. соответственно [25].Эти уникальные особенности белка AcSp1 вместе с исключительными физическими свойствами шелка, обернутого пауками, делают белок AcSp1 интересным предметом для изучения взаимосвязей между структурой и функцией рекомбинантного спидроина, а также механизмов образования шелка.

В этом исследовании мы впервые получили и изучили рекомбинантные белки оберточного шелка. Рекомбинантные белки, состоящие только из 200-аминокислотных повторов AcSp1, были получены в E. coli с относительно высокими выходами и слиты со съемной белковой меткой для аффинной очистки.Мы обнаружили, что всего лишь двух из 200-а.о. повторов было достаточно для образования шелкоподобных волокон, когда они индуцировались силами сдвига в физиологическом буфере, без необходимости в консервативном С-концевом неповторяющемся домене. Эти волокна имели малый диаметр и высокую растяжимость. Исследования с использованием микроскопических и биофизических методов выявили структурные изменения белков и возможные промежуточные продукты образования волокон.

Материалы и методы

Конструирование рекомбинантных плазмид

Для конструирования плазмидного вектора pEHU в плазмиду pET32 (New England Biolabs, Ипсвич, США) между сайтами рестрикции вставляли ДНК, кодирующую гексагистидиновую метку (метка H 6 ), слитую с белком SUMO. Nde I и Bam HI.Два дополнительных сайта рестрикции ( Bsa I и Bfu AI) были введены после кодирующей последовательности SUMO с помощью обратной ПЦР с использованием двух олигонуклеотидных праймеров: 5′-GAGGCGGTTAGCAGGTCAACACAGCTTATAC-3’T и 5′-GAGGTCTCTCCAGCT с рестриктазой GAGGTCTCTCCAGCT с рестриктазой ‘ подчеркнутые сайты.

Рекомбинантные гены (с W 1 по W 4 ) были сконструированы следующим образом. Кодирующая последовательность 200-аминокислотного повтора AcSp1 была создана в виде синтетического гена (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa).Последовательность из 200 аминокислот была основана на консенсусной повторяющейся последовательности Argiope trifasciata AcSp1, и ее кодирующая последовательность была разработана для оптимального использования кодонов E.coli без изменения аминокислотной последовательности. Эту кодирующую последовательность вставляли в плазмиду pDrive (New England Biolabs, Ipswich, USA) между сайтами рестрикции Mlu I и Xba I для получения плазмид pDW 1 и pDW 1a . В этих плазмидах кодирующая последовательность AcSp1 фланкирована 5′-последовательностью, содержащей сайтов Bse RI и Bsa I, и 3′-последовательностью, содержащей сайтов Bfu AI и Bsg I, pDW 1a отличается от pDW 1 , имея на 5′-конце еще 12 нуклеотидов, которые были разработаны для бесшовного слияния нескольких повторяющихся кодирующих последовательностей.Для конструирования генов, кодирующих два или более из 200-аминокислотных повторов, ранее описанная стратегия клонирования [24], [26] была использована следующим образом (проиллюстрирована на рисунке 1A). Плазмиды pDW 1 и pDW 1a были расщеплены отдельно для получения фрагмента Bam HI — Bsg I и фрагмента Bam HI — Bse RI, соответственно, и лигирование этих двух фрагментов ДНК дало плазмиды. pDW 2 кодирование двух повторов. Для создания плазмиды pDW 3 , которая кодировала три повтора, pDW 2 и pDW 1a были расщеплены для получения Bam HI — Bsg I фрагмента и Bam HI — Bse . соответственно, и лигирование этих двух фрагментов ДНК давало pDW 3 .Чтобы получить плазмиду pDW 4 , которая кодировала четыре повтора, pDW 3 и pDW 1a были расщеплены для получения Bam HI — Bsg I фрагмента и Bam HI — Bse . соответственно, и лигирование этих двух фрагментов ДНК давало pDW 4 .

Рисунок 1. Конструирование рекомбинантных белков, полученных из AcSp1.

(A) Схематическая иллюстрация стратегии конструирования рекомбинантных генов. Плазмида pW n (n = 1, 2 или 3) была расщеплена рестрикционными ферментами Bam HI и Bsg I, и полученный фрагмент Bam HI- Bsg I, содержащий кодировку W n . Последовательность лигировали с фрагментом RI Bam HI- Bse , выделенным из плазмиды pW 1a , содержащей кодирующую последовательность W 1a .Полученная плазмида pW n + 1 имеет кодирующие последовательности W n и W 1a , плавно слитые с получением кодирующей последовательности W n + 1 . (B) Схематическое изображение белков с W 1 по W 4 с указанием их размеров. (C) Аминокислотные последовательности. Тег H 6 -SUMO из 106 аминокислотных остатков был добавлен к N-концу белков с W 1 по W 4 . Последовательность W 1a из 200 аминокислотных остатков была получена из консенсусного повтора белка AcSp1 Argiope trifasciata [25].Последовательность W 1 из 199 аминокислот (не показана) была такой же, как W 1a , за исключением отсутствия N-концевого S-остатка.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0050227.g001

Для конструирования экспрессионной плазмиды pEHU-W 1 из плазмиды pDW был выделен 594 п.н. Bsa I — Bfu AI. 1 (см. Выше) и вставили в плазмиду pEHU (см. Выше) между теми же двумя сайтами. Аналогичным образом экспрессионные плазмиды pEHU-W 2 pEHU-W 3 и pEHU-W 4 были сконструированы путем выделения Bsa I — Bfu фрагментов AI из плазмид pDW 2 , pDW и 3. pDW 4 , соответственно, и вставку фрагментов в плазмиду pEHU между теми же двумя сайтами.Обратите внимание на то, что сайты разреза рестрикционных ферментов Bsa I, Bsg I, Bse RI и Bfu AI находятся за пределами их последовательностей распознавания, и это позволило бесшовное слияние кодирующих последовательностей.

Экспрессия и очистка белков

Каждую экспрессионную плазмиду трансформировали в E.coli BL21 (DE3) (Novagen, Дармштадт, Германия) с использованием стандартных протоколов. Клетки выращивали при 37 ° C в среде Лурия-Бертани, содержащей ампициллин (50 мкг / мл) до средней логарифмической фазы (OD 600 из 0.8 ~ 1,2), а затем индуцировали при комнатной температуре в течение ночи 0,8 мМ IPTG (изопропил β -D-тиогалактозид) для стимуляции экспрессии слитого белка, кодируемого плазмидой. Клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали в буфере для лизиса (10 мМ Трис-HCl, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, pH 8,0) и лизировали с использованием French Pressure Cell Press (American Instrument Company). Лизат клеток центрифугировали при 12000 об / мин в течение 15 минут при 4 ° C для удаления любых нерастворимых клеточных остатков, и полученный супернатант загружали в неденатурирующую колонку, заполненную Ni-NTA-сефарозой (Qiagen, Германия).Колонку промывали в соответствии с инструкциями производителя перед элюированием связанных белков в буфере для элюирования (10 мМ трис-HCl, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол, pH 8,0).

Очищенный гибридный белок обрабатывали протеазой SUMO для удаления метки H 6 -SUMO. В частности, слитый белок смешивали с протеазой в соотношении 100-1 (мас. / Мас.) И подвергали диализу против реакционного буфера (10 мМ Трис-Cl, pH 8,0) при 4 ° C в течение ночи, что не только позволяло протеазе расти. расщеплять слитый белок сайт-специфично после последовательности SUMO, но также удаляет имидазол из реакционной смеси.Затем реакционную смесь пропускали через колонку с Ni-NTA-сефарозой, рекомбинантный белок без метки протекал через колонку и собирали как очищенный белок, в то время как все другие белки (H 6 -SUMO tag, SUMO протеаза и любой оставшийся гибридный белок), содержащий метку H 6 , оставался связанным с колонкой. Образцы белка анализировали с помощью SDS-PAGE и визуализировали путем окрашивания кумасси бриллиантовым синим R-250. Концентрацию белка получали путем сравнения интенсивности полос белка со стандартным маркером белка (Fermentas) после сушки и сканирования гелей SDS-PAGE с использованием программного обеспечения Image J.

Идентификация очищенных белков W

1–4 с помощью масс-спектроскопии Образцы

обессоливали диализом, а затем анализировали масс-спектрометрией с ионизацией электрораспылением (ESI-MS). Все масс-спектры были получены на Waters Q-Tof Premier (Милфорд, Массачусетс), оборудованном источником наноэлектрораспыления. Образцы разбавляли приблизительно до 20 нг / мкл для W 1 , W 3 и W 4 и 40 нг / мкл для W 2 в 50% ацетонитриле с 0.1% муравьиной кислоты и настаивается со скоростью 5 мкл / мин. Масс-спектрометр сканировал от 100 до 4000 m / z со временем сканирования 1 секунда в режиме TOF MS. На конический наконечник для электрораспыления с внутренним диаметром 30 мкм подавали потенциал 3000 В. Напряжение конуса было установлено на 30 кВ, а температура источника установлена ​​на 100 ° C. Сбор данных выполняли с использованием Masslynx версии 4.1 (Waters Milford, MA).

Процедуры вытягивания волокна

Шелкоподобные волокна были извлечены из растворов очищенных белков без меток с W 2 по W 4 в буфере (10 мМ Tris.HCl, pH 8,0) при комнатной температуре. Обычно 20 мкл раствора белка (∼0,4 мг / мл) помещали на предметное стекло при комнатной температуре, и волокна извлекали из раствора белка с помощью пластикового наконечника пипетки на 200 мкл, где один конец волокна, по-видимому, прикреплялся к наконечник пипетки. Каждое тянущее действие представляло собой непрерывное движение со скоростью ~ 6 мм.с -1 .

Механические испытания шелковых волокон

Диаметр каждого волокна был измерен с помощью световой микроскопии перед испытанием его прочности на разрыв.Для каждого волокна были сделаны три цифровых фотографии при увеличении в 1000 раз, по одной возле двух концов, а также в середине волокна. На каждой фотографии были проанализированы три местоположения с помощью программного обеспечения Image Tool 2.0 для определения диаметра волокна. Полученные девять оценок диаметра для каждого волокна были усреднены. Площадь поперечного сечения каждого волокна рассчитывалась, исходя из предположения, что волокна имеют круглое поперечное сечение. После исключения волокон, которые либо имели неравномерную толщину или узлы под световым микроскопом, либо давали неполную кривую напряжения-деформации, средние механические свойства W 4 были получены для десяти волокон.

Предел прочности волокон при растяжении измеряли при 22,0 ± 2 ° C и влажности ~ 40% с использованием Agilent T150 UTM с наномеханическим приводным преобразователем (Agilent technologies, США). Волокна растягивали с постоянной скоростью 1% деформации / с относительно их исходной длины до тех пор, пока они не разорвались. Данные о силе и растяжении использовались для расчета инженерного напряжения и деформации соответственно. Программное обеспечение Testworks 4.0 (MTS Corp.) использовалось для визуализации кривых «напряжение-деформация», для расчета жесткости (модуль Юнга E) и для расчета ударной вязкости путем интегрирования площади под кривой «напряжение-деформация».

Биофизические характеристики белков и волокон

Спектры кругового дихроизма (КД) растворов белков регистрировали при 22 ± 2 ° C, от 260 до 190 нм в кварцевой кювете (длина пути 0,1 см) с использованием спектрополяриметра J-810 (Jasco, Токио, Япония) с скорость сканирования 20 нм / мин, время отклика 1 с, интервал сбора данных 1 нм и полоса пропускания 2 нм. Образцы готовили в 50 мМ фосфатном буфере, pH 7,5, с концентрацией белка ~ 0,06 мг / мл. Холостой раствор измеряли в тех же экспериментальных условиях и вычитали из данных.Были получены три сканирования и усреднены для каждого образца.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) была выполнена с использованием сканирующего электронного микроскопа Hitachi Cold Field Emission S-4700. Для визуализации структуры белкового раствора образец белка объемом 5 мкл (в 10 мМ Трис-Cl, pH 8,0) помещали на покровное стекло и оставляли на 15–30 минут, чтобы белки осели на поверхности, которая был покрыт поли-L-лизином. Впоследствии образец был первоначально зафиксирован 2,5% раствором глутарового альдегида (в 0.1M натрийкакодилатный буфер) в течение 2 часов, трижды промывали (по 10 минут каждый) 0,1 М натрийкакодилатным буфером и вторично фиксировали 1% тетроксидом осмия в течение 2 часов, промывали дистиллированной водой и дегидратировали в градиентной серии этанола. . После удаления этанола во время сушки в критической точке образец был покрыт частицами золота с помощью мини-распылителя SC7620 перед анализом SEM. Для получения изображения поперечного сечения волокна W 3 волокон были приклеены к бумажным рамкам с зазорами ∼1 мм.Волокна разрывались в жидком азоте путем складывания бумажных рамок и их разрыва в промежутках. Волокна с обрывающимися концами фиксировали на отрезке SEM путем приклеивания бумажных рамок к отрезку под углом ~ 45 ° и покрывали частицами золота перед анализом SEM.

Спектры комбинационного рассеяния света

шелковых волокон были записаны с помощью рамановского микроскопа inVia (Renishaw) при 21,0 ± 2 ° C и относительной влажности 30 ± 5%. Использовалась линия 632,8 нм гелий-неонового лазера, и лазерный луч фокусировался вниз объективом 100 × до диаметра примерно 2 мкм, создавая на образце интенсивность 6 мВт.Спектры были скорректированы на небольшой фон флуоресценции в спектральном диапазоне 400–1800 см –1 с использованием полиномиальной базовой линии. Для каждого образца были протестированы два независимых волокна и несколько позиций на каждом волокне для оценки однородности образца.

Результаты

Волокна, образованные из рекомбинантных белков, полученных из AcSp1

Ациниформный белок шелка AcSp1 из Argiope trifasciata содержит 200-аминокислотный повтор, который является высокогомогенным и повторяется по крайней мере 14 раз [25].Мы получили рекомбинантные белки, состоящие из одного-четырех из 200-аминокислотных консенсусных повторов AcSp1, и обозначили их от W 1 до W 4 (W = шелк для обертывания), соответственно (рис. 1). Метка H 6 -SUMO была добавлена ​​к N-концу каждого белка, чтобы обеспечить аффинную очистку, и было выполнено последующее удаление метки. Для экспрессии этих слитых белков в E. coli были сконструированы рекомбинантные плазмиды, как показано на рисунке 1. В этом процессе использовалась ранее описанная стратегия клонирования [26] для бесшовной сборки повторяющихся кодирующих последовательностей, а кодирование Последовательность была разработана для оптимального использования кодонов в E.coli без изменения аминокислотной последовательности. Каждой плазмидой трансформировали клеток E. coli для экспрессии слитого белка в 200 мл клеточной культуры.

Уровни экспрессии белка варьировались от ~ 80 мг (для H 6 -SUMO-W 1 ) до ~ 22 мг (для H 6 -SUMO-W 4 ) на литр клеточной культуры (рис. ). Все белки H 6 -SUMO-W 1 и H 6 -SUMO-W 2 были растворимы после клеточного лизиса, тогда как 60–80% белков H 6 -SUMO-W 3 и H 6 -SUMO-W 4 белков оставались растворимыми.Каждый слитый белок очищали от растворимой фракции клеточного лизата путем аффинного связывания метки H 6 с никелевыми шариками и в неденатурирующих условиях. Этот процесс обычно давал примерно 10-40 мг гибридного белка из каждого литра клеточной культуры E. coli , в зависимости от размера белка. Очищенные гибридные белки были стабильны при 4 ° C в течение по меньшей мере одной недели без видимого осаждения. При необходимости слитый белок обрабатывали протеазой SUMO при 4 ° C в течение ночи для отщепления метки H 6 -SUMO на С-конце SUMO.Когда продукты расщепления впоследствии пропускали через Ni-колонку при 4 ° C, только белки W 1 — W 4 без меток могли проходить через колонку и собираться как очищенные белки (рис. 2), в то время как все других белков (метка H 6 -SUMO, протеаза SUMO, любой оставшийся слитый белок) содержали метку H 6 и поэтому были захвачены на колонке. Белки с W 1 по W 4 очищали до уровня 95% или лучше, исходя из интенсивности окрашенных полос белка.Не удалось идентифицировать контаминирующие виды белка. Очищенные белки с W 1 по W 4 подтвердили правильную идентичность и полную длину с помощью масс-спектрометрического анализа (фиг. 3 и таблица 1).

Рисунок 2. Экспрессия и очистка белка.

Каждый слитый белок был экспрессирован в E.coli и проанализирован с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием кумасси синим с маркерами размера белка, показанными на дорожке М. (A) Экспрессия и очистка слитого белка H 6 -SUMO -W 1 .Дорожки 1 и 2 представляют собой общие клеточные белки до и после индуцированной IPTG экспрессии белка соответственно. Индуцированный клеточный лизат разделяли на растворимую (дорожка 3) и нерастворимую (дорожка 4) фракции, и растворимую фракцию пропускали через аффинную колонку с никелевыми шариками. Дорожка 5 показывает несвязанные белки, которые прошли через колонку, а дорожки 6-8 представляют собой три последовательные фракции, элюированные из колонки. (B) Удаление бирки H 6 -SUMO. Слитый белок H 6 -SUMO-W 1 (дорожки 1) расщепляли протеазой SUMO при 4 ° C в течение 6 часов (дорожка 2) и в течение ночи (дорожка 3).Полученный образец пропускали через аффинную колонку с никелевыми шариками, и белок W 1 без меток собирали в виде очищенного белка во фракции пролета (полоса 4). (C) Белки W 1 , W 2 , W 3 и W 4 , которые были экспрессированы и очищены, как на панелях A и B.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0050227.g002

Шелковые волокна, вытянутые из растворов очищенных белков W 2 — W 4 , имели длину приблизительно от 1 до 10 см.Они показали однородно гладкую поверхность и средний диаметр ~ 3,4 микрометра, а типичное волокно показано на рисунке 4. Мы протестировали различные концентрации белка в диапазоне от 0,04 до 0,6 мг / мл. Белки W 3 и W 4 легко образуют шелковидные волокна при любых концентрациях. Белок W 2 образовывал только более короткие волокна (<2 см) при более низких концентрациях белка (<0,1 мг / мл), и он образовывал гораздо меньше волокон даже при более высоких концентрациях белка (> 0.1 мг / мл) по сравнению с белками W 3 и W 4 . Мы протестировали разное время инкубации при комнатной температуре для белковых растворов на предметных стеклах перед тем, как начать процесс вытягивания шелковистых волокон из белкового раствора. Шелкоподобные волокна можно было сразу вытащить из белкового раствора, хотя больше шелковых волокон можно было вытянуть после более длительного периода инкубации. Мы также протестировали более низкие температуры и обнаружили, что волокна могут формироваться при температуре до 4 ° C.Шелкоподобные волокна, образованные из трех белков (W 2 , W 3 , W 4 ), имели одинаковые диаметры, и диаметры существенно не менялись при различных концентрациях белка и времени инкубации. Однако белок W 1 не образовывал шелкоподобных волокон ни при одной из протестированных концентраций белка и температур, даже после продолжительного времени инкубации, хотя этот белок мог образовывать микроскопические агрегаты (сфероиды) и нано-фибриллы, которые описаны ниже. .

Рис. 4. Внешний вид шелковистого волокна.

Волокно, образованное из белка W 3 , сфотографировали под световым микроскопом. Панель B соответствует области в рамке панели A с большим увеличением.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0050227.g004

Механические и физические свойства шелковых волокон

Многие из шелковых волокон из раствора белка W 4 были достаточно длинными (> 3 см) и однородными (без узлов), чтобы можно было проводить наномеханические испытания с использованием стандартных инструментов (например.г. Рисунок 5). Средние значения были получены для десяти волокон и сравнивались непосредственно с таковыми для нативных и рекомбинантных волокон шелка пауков в таблице 2. Расчетная прочность на разрыв волокон W 4 составила ~ 115 МПа, что составляет примерно одну шестую от сообщили о прочности на разрыв натурального оберточного шелка Argiope trifasciata . Средняя растяжимость волокон W 4 по расчетам составила ~ 37%, что примерно вдвое меньше заявленной растяжимости натурального оберточного шелка.Средняя вязкость волокон W 4 по расчетам составила ∼34 Дж / см −3 . Это менее одной десятой от заявленной прочности натурального оберточного шелка. Средний диаметр волокон W 4 составлял ~ 3,4 мкм. Это примерно в десять раз больше диаметра натурального оберточного шелка.

Рис. 5. Кривые напряжение-деформация и изображения под световым микроскопом двух репрезентативных волокон, образованных из белка W 4 .

Значения напряжения приведены к начальной площади поперечного сечения волокна.Деформация соответствует dL / L 0 , где L 0 — начальная длина волокна, а dL — изменение длины волокна.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0050227.g005

Чтобы определить, имеют ли волокна W 3 твердую или пористую структуру, волокна были заморожены и разорваны в жидком азоте, а оборванные концы были исследовали с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). СЭМ-изображения двух типичных волокон показаны на рис. 6E – H, причем одно волокно имеет плоский сломанный конец (рис. 6F), а другое волокно — наклонный сломанный конец (рис. 6H).Эти поперечные сечения показали, что волокна сплошные, а не полые или пористые.

Рис. 6. Сканирующие электронные микрофотографии (SEM) агрегатов (сфероидов) и фибрилл / волокон, образованных из белка W3.

Образец белка иммобилизовали либо с использованием метода влажной фиксации для сохранения сфероидов (панели A и B), либо с использованием метода сухой фиксации для удержания фибрилл (панели C и D). Для панели B раствор белка вращали кончиком пипетки для увеличения образования волокон перед фиксацией.Для визуализации макроволокна сухие волокна не обрабатывались каким-либо растворителем, но они были разрушены в жидком азоте, чтобы показать поперечное сечение волокна (панели от E до H). Панели D, F и H соответствуют областям, заключенным в рамку на панелях C, E и G, соответственно, с большим увеличением.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0050227.g006

Наблюдение за микроскопическими фибриллами и сферическими агрегатами в формировании волокна

Чтобы найти возможные промежуточные структуры формирования волокна, мы исследовали формирование волокна под световым микроскопом.Волокно вытягивали, но не до конца, из 5-мкл раствора белка W 3 на предметном стекле микроскопа, при этом хвостовой конец волокна все еще оставался в растворе. По данным инвертированной световой микроскопии зрелая часть волокна показала гладкую поверхность и диаметр около 4 мкм (рис. 4А). На хвостовом конце волокна были обнаружены многочисленные более мелкие фибриллы (рис. 4В).

Для визуализации более мелких структур четыре образца белка (W 1 — W 4 ) исследовали с помощью сканирующей электронной микроскопии.Каждый белковый раствор был иммобилизован на покровном стекле с использованием двух различных методов фиксации. Метод «влажной фиксации» использовался для лучшего сохранения содержащих воду мягких структур в их естественном состоянии, но с побочным эффектом, заключающимся в потере волокнистых материалов во время этапов стирки. Метод «сухой фиксации» лучше удерживал волокна, но с риском разрушения содержащих воду мягких структур на этапе сушки. Некоторые белковые растворы перемешивали (протягивали на предметном стекле) кончиком пипетки несколько раз в одном направлении, чтобы ввести силы сдвига с целью стимулирования образования волокон.Для белков W 2 , W 3 и W 4 наблюдалось обилие сферических структур и фибрилл, некоторые примеры которых показаны на рис. 6A – B для белка W 3 . Сфероиды не всегда круглые и имеют разные размеры. Некоторые сферы выстроились в линию с возможным слиянием с образованием мелких фибрилл (рис. 6В). Более мелкие фибриллы часто наблюдались на концах более крупных фибрилл или волокон (рис. 6C, D). Для белка W 1 сферы также наблюдались в большом количестве и иногда наблюдались очень мелкие фибриллы, хотя белок не мог образовывать шелкоподобные волокна.

Структурные изменения белка при образовании волокна

Во время формирования волокон рекомбинантные белки могли претерпевать структурные изменения, чтобы сформировать структуру β-листов, потому что такие структурные изменения были известны для некоторых других белков шелка. Чтобы исследовать эту возможность, мы сначала подвергли четыре рекомбинантных белка (W 1 — W 4 ) анализу кругового дихроизма (CD), чтобы выявить содержание их вторичной структуры. Четыре белка показали почти идентичные спектры КД (рис. 7А), несмотря на большие различия в размере и способности к образованию волокон.Каждый спектр КД показал две отрицательные полосы при 208 и 220 нм, а также положительную полосу при 192 нм. Эта комбинация полос является известным признаком α-спиральной структуры. Следовательно, вторичные структуры этих белков были преимущественно α-спиральными, когда находились в растворе до образования волокон. Затем мы использовали рамановскую спектроскопию, чтобы выявить содержание вторичной структуры шелкоподобных волокон, образованных из белка W 4 . Пять волокон, которые мы проанализировали, дали почти идентичные спектры комбинационного рассеяния, типичный спектр которого показан на рисунке 7B.После разложения полосы амида I спектра α-спираль и β-лист видны как меньший пик при 1655 см −1 и больший пик при 1670 см −1 , соответственно (рис. 7C), что указывает на что в волокне присутствуют как α-спиральные, так и β-листовые структуры [23], [27].

Рисунок 7. Анализ вторичных структур белков.

(А) Спектры КД белков W 1 , W 2 , W 3 и W 4 в растворе. (B) Рамановские спектры волокна, сформированного из белка W 4 .(C) Спектральное разложение в области амида I шелка W 4 .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0050227.g007

Обсуждение

Мы получили рекомбинантный фрагмент белка AcSp1 паука, способного образовывать шелкоподобные волокна. Насколько нам известно, это первое исследование рекомбинантного белка оберточного шелка, при этом предыдущие исследования в основном фокусировались на белках шелка драглайна. Мы определили минимальный размер рекомбинантного белка AcSp1, необходимый для образования шелкоподобных волокон.Рекомбинантные белки (W 2 — W 4 ), состоящие всего из двух из 200-аминокислотных повторов AcSp1, были способны образовывать шелкоподобные волокна. Это значительно короче по сравнению с нативным белком AcSp1, который содержит по крайней мере 14 таких повторов. Белок (W 1 ), состоящий только из одного из 200-а.о. повторов, обильно образовывал сферические структуры и иногда небольшие фибриллы, что указывает на то, что этот небольшой белок также был способен самособираться, хотя полученные микроскопические структуры не образовывали макроскопический шелк. -подобные волокна.Было несколько удивительно, что белки с W 2 по W 4 образуют шелкоподобные волокна без необходимости в C-концевом неповторяющемся домене белка AcSp1, учитывая, что C-концевой домен является консервативным среди различных белков шелка пауков. и считается, что он играет важную роль в формировании волокон в естественных и некоторых искусственных условиях [17], [18], [28].

Волокна, образованные из рекомбинантного белка W 4 , состоящего из четырех из 200-аминокислотных повторов AcSp1, проявляли свойства шелка, включая размер волокна, внешний вид и прочность.Волокна W 4 имели длину до 10 сантиметров, и эта длина, вероятно, ограничивалась размером и количеством белка, поскольку мы заметили, что более длинные волокна легче получить из более крупных белков (например, сравнивая W 4 и W 2). белков), больших объемов раствора и более высоких концентраций белка. Волокна W 4 показали относительно однородную толщину (средний диаметр ~ 3,4 мкм) при наблюдении под микроскопом. Диаметр этих искусственных волокон больше заявленного диаметра (∼0.35 мкм) натурального шелка, обертывающего пауков [25], вероятно, из-за искусственных условий, использованных в этом исследовании для формирования волокон. Волокно W 4 , использованное в этом исследовании, показало высокую прочность на разрыв и эластичность, что также свидетельствует о шелковистом волокне. Средняя эластичность (растяжимость, в среднем 37%) волокна W 4 составляла почти половину заявленной растяжимости (86%) натурального оберточного шелка, а средняя прочность на разрыв (прочность на разрыв, ~ 115 МПа) достигала одной шестой от заявленная прочность на разрыв (687 МПа) натурального оберточного шелка.По сравнению с искусственными шелковидными волокнами, образованными из рекомбинантных белков драглайнового шелка в различных условиях [29], волокно W 4 имело гораздо более высокую эластичность, хотя его прочность на растяжение была ниже, чем у шелкоподобных волокон, полученных из нативного волокна. -размерный протеин шелка драглайна. В целом, физические свойства волокна W 4 свидетельствуют о шелковистом волокне.

Образование шелкоподобных волокон из рекомбинантных белков, полученных из AcSp1 (W 2 , W 3 и W 4 ), указывает на сборку этих белков под действием сдвига и может пролить свет на механизм образования волокон. .Белки явно образуют микроскопические структуры, которые могут отражать, а могут и не отражать промежуточные этапы формирования шелкоподобных волокон. Мы наблюдали небольшие сферические структуры и мелкие фибриллы различного размера, когда раствор белка анализировали под электронным микроскопом и световым микроскопом. При некоторых условиях казалось, что маленькие сферы выстраиваются в линию на заднем конце фибрилл, а маленькие фибриллы появляются на заднем конце шелкоподобных волокон. Ранее сферические структуры и маленькие фибриллы также наблюдались с другими рекомбинантными белками паучьего шелка [10], [12], [30], однако редко или беспрецедентно наблюдать сферы, выстраивающиеся за фибриллами, и фибриллы, тянущиеся за шелкоподобными волокнами.Наши результаты предполагают, но не доказывают окончательно, что сферы выстраиваются в линию, образуя фибриллы, а фибриллы могут объединяться, образуя шелковые волокна. Таким образом, наши результаты согласуются с ранее предложенной «теорией мицелл» для образования шелков тутового шелкопряда [31] с оговоркой, что неизвестно, являются ли сферические структуры, наблюдаемые в нашем исследовании, строго говоря, мицеллами.

Процесс образования волокон из рекомбинантных белков, полученных из AcSp1, также включает изменения во вторичных структурах белка.Перед формированием волокон вторичные структуры белков в растворе, по-видимому, были в основном α-спиральными, как показала спектроскопия КД. В шелкоподобных волокнах вторичная структура белка представляла собой смесь как α-спирали, так и β-листа, на что указывают спектры комбинационного рассеяния шелкоподобных волокон. Следовательно, переход от α-спирали к β-листу произошел в структуре белка во время формирования волокна, хотя неизвестно, как и когда именно произошло это изменение. Это согласуется с более ранними открытиями с другими белками шелка, где образование β-листовой структуры из неупорядоченных или других структур во время формирования волокон считалось ответственным за высокую прочность на разрыв шелковых волокон [32], [33].Наши результаты также согласуются с более ранними исследованиями белков и волокон натурального оберточного шелка, поскольку содержание белка в ациниформной железе Nephila clavipes было в основном α-спиральным [23], в то время как содержание белка в натуральном оберточном шелковом волокне из Nephila clavipes обнаружил обильный характер β-пластинки и некоторый спиральный характер [34].

Внедрение рекомбинантного белка шелка пауков AcSp1 может способствовать разработке полезных биоматериалов, которые отличаются от других искусственных шелков пауков некоторыми свойствами.Среди различных типов паучьего шелка драглайновый шелк имеет самую высокую прочность на разрыв, жгутиковый шелк имеет самую высокую эластичность, а оберточный шелк имеет самую высокую прочность благодаря сочетанию высокой прочности на разрыв и высокой эластичности [25]. Волокна W 4 все еще не такие прочные и эластичные, как натуральный оберточный шелк, что, скорее всего, связано с тем, что белок W 4 намного меньше, чем нативный белок AcSp1. Ранее искусственные волокна, сформированные из более мелких белков шелка драглайна, также демонстрировали более низкую прочность на разрыв и эластичность, чем искусственные или натуральные волокна, сформированные из белков шелка драглайна естественного размера [5], [29].На прочность и эластичность волокна также могут влиять условия формирования волокна, как это наблюдалось с другими протеинами шелка [5], [15]. Следовательно, должно быть возможно значительно увеличить прочность и эластичность волокон W 4 за счет увеличения размера рекомбинантного белка и разработки метода прядения волокон, который включает процесс последующего вытягивания. И наоборот, изменение и оптимизация процесса производства волокна может привести к более естественным свойствам даже с W 4 .В целом рекомбинантный оберточный шелк может обеспечить новые биоматериалы исключительной прочности, на что уже указывает высокая эластичность и значительная прочность на разрыв волокон W 4 . Исключительно малый диаметр волокон W 4 может быть еще одним преимуществом для определенных приложений. Например, в микрохирургии можно использовать очень тонкую мононить. В целом, наши открытия привели к созданию новой системы для изучения свойств и формирования искусственных волокон, которые могут привести к разработке и производству интересных биоматериалов с желаемыми свойствами.

Заключение

Мы показываем, что рекомбинантные белки, полученные из белка шелка, обертывающего пауков, AcSp1, могут образовывать шелкоподобные волокна посредством сборки под действием сдвига в физиологическом буфере. Волокна показали относительно небольшой (~ 3,4 мкм) диаметр, высокую прочность на разрыв и эластичность, которые отражают свойства натуральных шелковых оберточных материалов. Для сборки в шелковые волокна рекомбинантному белку потребовалось всего два 200-аминокислотных повтора AcSp1, в отличие от 14 в нативном шелке паука.Более того, С-концевой консервативный неповторяющийся домен не требовался. Формирование волокна, по-видимому, включает сборку рекомбинантных белков в микросферы, нанофибриллы и шелкоподобные волокна. Определение вторичной структуры белка показало переход от преимущественно α-спиральной формы в растворе к возрастанию количества β-листов в волокнах. Наше исследование представляет новую систему для изучения механизмов самосборки белков паучьего шелка в формировании шелковых волокон, предоставляя уникальную возможность для сравнения двух разных классов (ациниформный шелк иmajor ampullate silk) белков паучьего шелка и имеет выдающиеся перспективы для создания биоматериалов с желаемыми свойствами.

Благодарности

Мы благодарим Yanfei Wang за техническую поддержку в генных препаратах; Мэри Энн Тревор, доктор Пинг Ли и Патриция Скаллион за анализ с помощью SEM; Сяоюнь Лю за работу с рамановским микроспектрометром; Доктору Стивену Берну за помощь с CD, Кену Чизолму за помощь с ESI-MS и доктору Дэвиду Спенсеру за критическое прочтение рукописи.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: XL LX QM. Проведены эксперименты: LX. Проанализированы данные: XL LX JKR. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: XL QM JKR. Написал статью: XL LX JKR.

Ссылки

  1. 1. Fu C, Shao Z, Fritz V (2009) Шелк животных: их структура, свойства и искусственное производство. Chem Commun (Camb): 6515–6529.
  2. 2. Allmeling C, Jokuszies A, Reimers K, Kall S, Vogt PM (2006) Использование волокон паучьего шелка в качестве инновационного материала в биосовместимом искусственном нервном проводнике.J Cell Mol Med 10: 770–777.
  3. 3. Wendt H, Hillmer A, Reimers K, Kuhbier JW, Schafer-Nolte F, et al. (2011) Искусственная кожа — культивирование различных линий клеток кожи для создания искусственного заменителя кожи на поперечно переплетенных волокнах паучьего шелка. PLoS One 6: e21833.
  4. 4. Widhe M, Johansson J, Hedhammar M, Rising A (2012) Приглашенный обзор текущего прогресса и ограничений паучьего шелка для биомедицинских приложений. Биополимеры 97: 468–478.
  5. 5.Ся ХХ, Цянь З.Г., Ки С.С., Пак Й.Х., Каплан Д.Л. и др. (2010) Рекомбинантный белок шелка паука естественного размера, продуцируемый метаболически модифицированной Escherichia coli, дает прочное волокно. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 14059–14063.
  6. 6. Xu HT, Fan BL, Yu SY, Huang YH, Zhao ZH и др. (2007) Сконструировать синтетический ген, кодирующий протеин искусственного шелка драглайна пауков и его экспрессию в молоке трансгенных мышей. Anim Biotechnol 18: 1–12.
  7. 7. Fahnestock SR, Bedzyk LA (1997) Производство синтетического протеина шелка пауков-драглайнов в Pichia pastoris.Appl Microbiol Biotechnol 47: 33–39.
  8. 8. Мяо И, Чжан И, Накагаки К., Чжао Т., Чжао А. и др. (2006) Экспрессия белка жгутикового шелка паука в клеточной линии Bombyx mori с помощью новой системы экспрессии бакуловируса Bac-to-Bac / BmNPV. Appl Microbiol Biotechnol 71: 192–199.
  9. 9. Чжан И, Ху Дж, Мяо И, Чжао А., Чжао Т. и др. (2008) Экспрессия слитого белка шелка драглайнов EGFP-пауков в клетках BmN и личинках тутового шелкопряда показала, что растворимость является основным пределом выхода белков драглайна.Mol Biol Rep 35: 329–335.
  10. 10. Lin Z, Huang W, Zhang J, Fan JS, Yang D (2009) Структура раствора шелкового белка из яичной оболочки и ее значение для образования шелковых волокон. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 8906–8911.
  11. 11. Иттах С., Барак Н., Гат У. (2010) Предлагаемая модель самосборки шелка паука драглайна: понимание влияния повторяющегося размера домена на свойства волокна. Биополимеры 93: 458–468.
  12. 12. Работягова О.С., Цебе П., Каплан Д.Л. (2009) Самосборка генно-инженерных блок-сополимеров паучьего шелка.Биомакромолекулы 10: 229–236.
  13. 13. Huemmerich D, Scheibel T, Vollrath F, Cohen S, Gat U, et al. (2004) Новые свойства сборки рекомбинантных белков шелка драглайнов пауков. Curr Biol 14: 2070–2074.
  14. 14. Rammensee S, Slotta U, Scheibel T, Bausch AR (2008) Механизм сборки рекомбинантных белков шелка паука. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 6590–6595.
  15. 15. Lazaris A, Arcidiacono S, Huang Y, Zhou JF, Duguay F, et al. (2002) Волокна шелка паука прядут из растворимого рекомбинантного шелка, полученного в клетках млекопитающих.Наука 295: 472–476.
  16. 16. Старк М., Грип С., Восходящий А., Хедхаммар М., Энгстром В. и др. (2007) Макроскопические волокна самоорганизуются из рекомбинантных белков шелка миниатюрного паука. Биомакромолекулы 8: 1695–1701.
  17. 17. Итта С., Коэн С., Гарти С., Кон Д., Гат У. (2006) Существенная роль С-концевого домена белка шелка паука-драглайна в управлении образованием волокон. Биомакромолекулы 7: 1790–1795.
  18. 18. Hagn F, Eisoldt L, Hardy JG, Vendrely C, Coles M и др.(2010) Консервативный домен паучьего шелка действует как молекулярный переключатель, который контролирует сборку волокон. Природа 465: 239–242.
  19. 19. Heim M, Keerl D, Scheibel T (2009) Шелк паука: от растворимого белка до необычных волокон. Angew Chem Int Ed Engl 48: 3584–3596.
  20. 20. Ху X, Васантхавада К., Колер К., Макнари С., Мур AM и др. (2006) Молекулярные механизмы паучьего шелка. Cell Mol Life Sci 63: 1986–1999.
  21. 21. Хинман М.Б., Джонс Дж. А., Льюис Р. В. (2000) Синтетический паучий шелк: модульное волокно.Trends Biotechnol 18: 374–379.
  22. 22. Scheibel T (2004) Шелк паука: рекомбинантный синтез, сборка, прядение и инженерия синтетических белков. Факт о микробных клетках 3: 14.
  23. 23. Lefevre T, Boudreault S, Cloutier C, Pezolet M (2011) Разнообразие молекулярных преобразований, участвующих в формировании паучьих шелков. J Mol Biol 405: 238–253.
  24. 24. Heim M, Ackerschott CB, Scheibel T (2010) Характеристика рекомбинантно полученных доменов жгутикового шелка пауков.J. Struct Biol 170: 420–425.
  25. 25. Hayashi CY, Blackledge TA, Lewis RV (2004) Молекулярная и механическая характеристика ациниформного шелка: единообразие повторяющихся модулей последовательности в новом члене семейства гена фиброина шелка паука. Mol Biol Evol 21: 1950–1959.
  26. 26. Huemmerich D, Helsen CW, Quedzuweit S, Oschmann J, Rudolph R et al. (2004) Элементы первичной структуры шелка драглайнов пауков и их вклад в растворимость белков. Биохимия 43: 13604–13612.
  27. 27. Гринфилд Н.Дж. (1996) Методы оценки конформации белков и полипептидов по данным кругового дихроизма. Анальный Биохим 235: 1–10.
  28. 28. Hedhammar M, Rising A, Grip S, Martinez AS, Nordling K и др. (2008) Структурные свойства рекомбинантных неповторяющихся и повторяющихся частей спидроина 1 большой ампулаты из Euprosthenops australis: значение для образования волокон. Биохимия 47: 3407–3417.
  29. 29. Grip S, Johansson J, Hedhammar M (2009) Разработанные дисульфиды улучшают механические свойства рекомбинантного паучьего шелка.Protein Sci 18: 1012–1022.
  30. 30. Ламмель А., Шваб М., Слотта У, Винтер Г., Шейбель Т. (2008) Условия обработки для формирования микросфер паучьего шелка. ChemSusChem 1: 413–416.
  31. 31. Джин Х. Дж., Каплан Д. Л. (2003) Механизм обработки шелка у насекомых и пауков. Природа 424: 1057–1061.
  32. 32. Nova A, Keten S, Pugno NM, Redaelli A, Buehler MJ (2010) Молекулярные и наноструктурные механизмы деформации, прочности и вязкости волокон шелка пауков.Nano Lett 10: 2626–2634.
  33. 33. Giesa T, Arslan M, Pugno NM, Buehler MJ (2011) Наноконфинирование волокон шелка паука порождает превосходную прочность, растяжимость и жесткость. Nano Lett 11: 5038–5046.
  34. 34. Rousseau ME, Lefevre T, Pezolet M (2009) Конформация и ориентация белков в различных типах шелковых волокон, производимых пауками Nephila clavipes. Биомакромолекулы 10: 2945–2953.

Дублирование и согласованная эволюция генов, кодирующих MiSp, лежат в основе материальных свойств второстепенных ампулярных шелков пауков, плетущих паутину | BMC Ecology and Evolution

  • 1.

    Foelix RF. Биология пауков. 3-е изд. Нью-Йорк: издательство Оксфордского университета; 2011.

    Google Scholar

  • 2.

    Гейтси Дж., Хаяши С., Мотрюк Д., Вудс Дж., Льюис Р. Экстремальное разнообразие, сохранение и конвергенция последовательностей фиброина шелка паука. Наука. 2001; 291: 2603–5.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 3.

    Guerette PA, Ginzinger DG, Weber BH, Gosline JM.Свойства шелка определяются специфической экспрессией гена семейства фиброиновых пауков. Наука. 1996. 272: 112–5.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 4.

    Воллрат Ф. Паутина и шелк. Sci Am. 1992; 266: 70–6.

    CAS Статья Google Scholar

  • 5.

    Mattina CL, Reza R, Hu X, Falick AM, Vasanthavada K, McNary S, et al. Белки ампульного шелка малого паука входят в состав шелка, оборачивающего добычу у ткача Latrodectus hesperus † .Биохимия (Москва). 2008; 47: 4692–700.

    Артикул Google Scholar

  • 6.

    Blackledge TA, Summers AP, Hayashi CY. Линии с прорезями в паутине черной вдовы и механические свойства паучьего шелка. Зоология. 2005; 108: 41–6.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 7.

    Gosline JM, DeMont ME, Denny MW. Строение и свойства паучьего шелка.Стараться. 1986; 10: 37–43.

    Артикул Google Scholar

  • 8.

    Блэкледж Т.А., Хаяши К.Ю. Наборы инструментов для шелка: биомеханика шелковых волокон, сотканных паутиной сфер Argiope argentata (Fabricius 1775). J Exp Biol. 2006; 209: 2452–61.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 9.

    Хаяши С.Ю., Блэкледж Т.А., Льюис Р.В. Молекулярная и механическая характеристика ациниформного шелка: единообразие повторяющихся модулей последовательности в новом члене семейства генов фиброина шелка паука.Mol Biol Evol. 2004; 21: 1950–9.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 10.

    Лийвак О., Флорес А., Льюис Р., Елински Л.В. Конформация полиаланиновых повторов в шелке малой ампулярной железы паука Nephila clavipes . Макромолекулы. 1997; 30: 7127–30.

    CAS Статья Google Scholar

  • 11.

    Pérez-Rigueiro J, Elices M, Llorca J, Viney C.Прочность на растяжение шёлка Argiope trifasciata , полученного из паутины. J Appl Polym Sci. 2001; 82: 2245–51.

    Артикул Google Scholar

  • 12.

    Суонсон Б.О., Блэкледж Т.А., Бельтран Дж., Хаяши К.Ю. Различия в материальных свойствах шелка драглайна пауков у разных видов. Appl Phys A. 2006; 82: 213–8.

    CAS Статья Google Scholar

  • 13.

    Guinea GV, Elices M, Plaza GR, Perea GB, Daza R, Riekel C, et al. Незначительные ампульные шелка пауков Nephila и Argiope : свойства при растяжении и микроструктурные характеристики. Биомакромолекулы. 2012; 13: 2087–98.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 14.

    Пападопулос П., Эне Р., Вайднер И., Кремер Ф. Сходства в структурной организации большого и второстепенного ампулярного шелка паука.Macromol Rapid Commun. 2009. 30: 851–7.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 15.

    Stauffer SL, Coguill SL, Lewis RV. Сравнение физических свойств трех шелков из Nephila clavipes и Araneus gemmoides . J Arachnol. 1994; 5–11.

  • 16.

    Ayoub NA, Garb JE, Tinghitella RM, Collin MA, Hayashi CY. Чертеж высокоэффективного биоматериала: гены шелка драглайна в полный рост.PLoS One. 2007; 2, с514.

    Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 17.

    Ayoub NA, Garb JE, Kuelbs A, Hayashi CY. Древние свойства паучьего шелка раскрываются полной генной последовательностью белка шелка, оборачивающего добычу (AcSp1). Mol Biol Evol. 2013; 30: 589–601.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 18.

    Хаяши К.Ю., Шипли Н.Х., Льюис Р.В.Гипотезы, которые коррелируют последовательность, структуру и механические свойства белков паучьего шелка. Int J Biol Macromol. 1999; 24: 271–5.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 19.

    Мотрюк-Смит Д., Смит А., Хаяши С. Ю., Льюис Р. В.. Анализ консервативных N-концевых доменов в белках шелка крупных ампул. Биомакромолекулы. 2005; 6: 3152–9.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 20.

    Sponner A, Schlott B, Vollrath F, Unger E, Grosse F, Weisshart K. Характеристика белковых компонентов Nephila clavipes Dragline silk. Биохимия (Москва). 2005; 44: 4727–36.

    CAS Статья Google Scholar

  • 21.

    Васантхавада К., Ху Х, Фалик А.М., Ла Маттина С., Мур А.М., Джонс П.Р. и др. Ациниформный спидроин, составляющий мешочки для яиц и обертывающий шелковые волокна паука черной вдовы Latrodectus hesperus .J Biol Chem. 2007. 282: 35088–97.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 22.

    Голландия GP, Дженкинс Дж. Э., Creager MS, Льюис Р. В., Яргер Дж. Л.. Количественное определение доли глицина и аланина в β-листовых и спиральных конформациях в шелке драглайна пауков с использованием твердотельного ЯМР. Chem Commun. 2008; 43: 5568–70.

    Артикул Google Scholar

  • 23.

    Голландия GP, Creager MS, Jenkins JE, Lewis RV, Yarger JL.Определение вторичной структуры шелка драглайна пауков методом твердотельной ЯМР-спектроскопии углерод-углеродной корреляции. J Am Chem Soc. 2008; 130: 9871–7.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 24.

    Дженкинс Дж. Э., Creager MS, Льюис Р. В., Голландия GP, Яргер Дж. Л.. Количественная корреляция между первичными последовательностями белков и вторичными структурами в шелках драглайнов пауков. Биомакромолекулы. 2009; 11: 192–200.

    Артикул Google Scholar

  • 25.

    Дженкинс Дж. Э., Крегер МС, Батлер Э. Б., Льюис Р. В., Яргер Дж. Л., Голландия, GP. Твердотельный ЯМР-свидетельство эластиноподобной структуры β-витков в шелке драглайна пауков. Chem Commun. 2010. 46: 6714–6.

    CAS Статья Google Scholar

  • 26.

    van Beek JD, Hesst S, Vollrath F, Meier BH. Молекулярная структура шелка драглайна паука: складывание и ориентация белкового остова. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2002; 99: 10266–71.

    Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 27.

    Хинман МБ, Льюис Р.В. Выделение клона, кодирующего второй фиброин шелка драглайна. Nephila clavipes шелк драглайна — это двухбелковое волокно. J Biol Chem. 1992; 267: 19320–4.

    CAS PubMed Google Scholar

  • 28.

    Сюй М., Льюис Р.В. Состав протеинового суперволокна: шелк драглайна паука. Proc Natl Acad Sci. 1990; 87: 7120–4.

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 29.

    Колгин М.А., Льюис Р.В. Белки шелка в малой ампулате пауков содержат новые повторяющиеся последовательности и высококонсервативные не шелкоподобные «спейсерные области». Protein Sci. 1998. 7: 667–72.

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 30.

    Чен Дж., Лю Х, Чжан И, Лин С., Янг З., Йоханссон Дж. И др. Полноразмерная малая ампулярная последовательность гена спидроина. PloS One. 2012; 7, e52293.

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 31.

    Gao Z, Lin Z, Huang W, Lai CC, Fan J, Yang D. Структурная характеристика спидроиновых доменов минорных ампул и их различных ролей в растворимости фиброина и формировании волокон. PLoS ONE. 2013; 8, e56142.

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 32.

    Garb JE, Ayoub NA, Hayashi CY. Эволюция распутывающегося паучьего шелка с концевыми доменами спидроина. BMC Evol Biol. 2010; 10: 243.

    Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 33.

    Wheelan SJ, Церковь DM, Ostell JM. Spidey: инструмент для выравнивания мРНК и генома. Genome Res. 2001; 11: 1952–7.

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 34.

    Garb JE, González A, Gillespie RG. Род паука черной вдовы Latrodectus (Araneae: Theridiidae): филогения, биогеография и история вторжений. Mol Phylogenet Evol. 2004; 31: 1127–42.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 35.

    Лю Дж., Май-Колладо Л.Дж., Пекар С., Агнарссон И. Пересмотренная и датированная филогения паутинных пауков (Araneae, Araneoidea, Theridiidae): хищная меловая линия, диверсифицировавшаяся в эпоху муравьев (Hymenoptera, Formicidae). Mol Phylogenet Evol. 2015; 94: 658–75.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 36.

    Бонд Дж. Э., Гаррисон Н. Л., Гамильтон, Калифорния, Годвин Р. Л., Хедин М., Агнарссон И. Филогеномика решает проблему филогенеза паучьего остова и отвергает преобладающую парадигму эволюции орбитальной сети.Curr Biol. 2014; 24: 1765–71.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 37.

    Coddington JA. Филогения и классификация пауков. В: Ubick D, Paquin P, Cushing PE, Roth V, редакторы. Пауки Северной Америки: и Руководство по идентификации. 2005. с. 18-24.

  • 38.

    Гаррисон Н.Л., Родригес Дж., Агнарссон И., Коддингтон Дж. А., Грисволд СЕ, Гамильтон, Калифорния и др. Филогеномика пауков: распутывание паучьего древа жизни.PeerJ. 2016; 4, с1719.

    Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 39.

    Димитров Д., Бенавидес Л. Р., Арнедо М. А., Гирибет Г., Грисволд К. Э., Шарфф Н. и др. Обращение к обычным подозреваемым: стандартный подход к генам-мишеням для разрешения межсемейных филогенетических взаимоотношений экрибеллятных пауков, плетущих круговые орбиты, с новой классификацией семейного ранга (Araneae, Araneoidea). Кладистика. 2016; онлайн рано.

  • 40.

    Старретт Дж., Гарб Дж. Э., Куэлбс А., Азубуике Ю. О., Хаяши С. Ю.. Ранние события в эволюции генов паучьего шелка. PLoS One. 2012; 7, e38084.

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 41.

    Ayoub NA, Hayashi CY. Множественные рекомбинирующие локусы кодируют MaSp1, основной компонент шелка драглайна, у пауков-вдов ( Latrodectus : Theridiidae). Mol Biol Evol. 2008. 25: 277–86.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 42.

    Beckwitt R, Arcidiacono S, Stote R. Эволюция повторяющихся белков: паучьи шелка из Nephila clavipes (Tetragnathidae) и Araneus bicentenarius (Araneidae). Насекомое Biochem Mol Biol. 1998. 28: 121–30.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 43.

    Rising A, Johansson J, Larson G, Bongcam-Rudloff E, Engström W., Hjälm G. Основные спидроины в ампулах из Euprosthenops australis : множественность на уровне белка, мРНК и гена.Насекомое Mol Biol. 2007. 16: 551–61.

    CAS PubMed Google Scholar

  • 44.

    Итта С., Коэн С., Гарти С., Кон Д., Гат У. Существенная роль C-концевого домена белка шелка пауков-драглайнов в управлении образованием волокон. Биомакромолекулы. 2006; 7: 1790–5.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 45.

    Чау Р.С., Чжао Ю., Вэй Дж., Аюб Н.А., Аллен Р., Атруши К. и др.Внутригенная гомогенизация и множественные копии генов шелка, покрывающего добычу, у садовых пауков Argiope . BMC Evol Biol. 2014; 14:31.

    Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 46.

    Хаяши С.Ю., Льюис Р.В. Молекулярная архитектура и эволюция модульного гена белка шелка паука. Наука. 2000; 287: 1477–9.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 47.

    Blamires SJ, Chao I-C, Tso I-M. Тип добычи, вибрации и обращение с ней интерактивно влияют на выражение паучьего шелка. J Exp Biol. 2010; 213: 3906–10.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 48.

    Tso I-M, Wu H-C, Hwang I-R. Гигантский древесный паук Nephila pilipes изменяет протеин шелка в ответ на изменение добычи. J Exp Biol. 2005; 208: 1053–61.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 49.

    Lane AK, Hayashi CY, Whitworth GB, Ayoub NA. Комплексная экспрессия генов в железах, продуцирующих шелк драглайнов, у западной черной вдовы ( Latrodectus hesperus ). BMC Genomics. 2013; 14: 1.

    Артикул Google Scholar

  • 50.

    Beuken E, Vink C, Bruggeman CA. Повышенная эффективность клонирования FACS ® -сортированных клеток млекопитающих. Биотехнологии. 1998. 24: 750–2.

    Google Scholar

  • 51.

    Альтшул С.Ф., Гиш В., Миллер В., Майерс Е. В., Липман Д. Д.. Базовый инструмент поиска локального выравнивания. J Mol Biol. 1990; 215: 403–10.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 52.

    BLAST Query | i5k — Приложение [Интернет]. [цитируется 3 июня 2014 г.]. Доступно по адресу: https://i5k.nal.usda.gov/webapp/blast/.

  • 53.

    Консорциум i5K. Инициатива i5K: развитие геномики членистоногих на благо знаний, здоровья человека, сельского хозяйства и окружающей среды.J Hered. 2013; 104: 595–600.

    Артикул PubMed Central Google Scholar

  • 54.

    Peden J. codonW [Интернет]. [цитируется 7 июля 2015 г.]. Доступно по адресу: http://codonw.sourceforge.net/.

  • 55.

    Kyte J, Дулиттл РФ. Простой способ показать водный характер протеина. J Mol Biol. 1982; 157: 105–32.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 56.

    Заявка на участие в Kyte-Doolittle [Интернет]. [цитируется 6 июля 2015 г.]. Доступно по адресу: http://gcat.davidson.edu/rakarnik/kyte-doolittle.htm.

  • 57.

    Ньюман А.М., Купер Дж. Б.. XSTREAM: практический алгоритм для идентификации и моделирования архитектуры тандемных повторов в белковых последовательностях. BMC Bioinformatics. 2007; 8: 382.

    Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 58.

    Clarke TH, Garb JE, Hayashi CY, Arensburger P, Ayoub NA.Транскриптомы пауков идентифицируют древнее крупномасштабное событие дупликации генов, потенциально важное в эволюции шелковых желез. Genome Biol Evol. 2015; 7: 1856–70.

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 59.

    Langmead B, Salzberg SL. Быстрое согласование с пропуском чтения с Bowtie 2. Натр. Методы. 2012; 9: 357–9.

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 60.

    Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N и др. Формат выравнивания / карты последовательностей и SAMtools. Биоинформатика. 2009; 25: 2078–9.

    Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 61.

    Galtier N, Gouy M, Gautier C. SEAVIEW и PHYLO_WIN: два графических инструмента для выравнивания последовательностей и молекулярной филогении. Comput Appl Biosci CABIOS. 1996; 12: 543–8.

    CAS PubMed Google Scholar

  • 62.

    Gouy M, Guindon S, Gascuel O. SeaView, версия 4: мультиплатформенный графический пользовательский интерфейс для выравнивания последовательностей и построения филогенетического дерева. Mol Biol Evol. 2010; 27: 221–4.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 63.

    Swofford DL. PAUP * версия 4.0 b10. Сандерленд: Синауэр; 2002.

    Google Scholar

  • 64.

    Huelsenbeck JP, Ronquist F. MRBAYES: Байесовский вывод филогенетических деревьев.Биоинформатика. 2001; 17: 754–5.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 65.

    Ronquist F, Huelsenbeck JP. MrBayes 3: байесовский филогенетический вывод в смешанных моделях. Биоинформатика. 2003; 19: 1572–4.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 66.

    Посада Д. jModelTest: усреднение филогенетической модели. Mol Biol Evol. 2008; 25: 1253–6.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 67.

    Abascal F, Zardoya R, Posada D. ProtTest: выбор наиболее подходящих моделей эволюции белка. Биоинформатика. 2005; 21: 2104–5.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 68.

    Durand D, Halldórsson BV, Vernot B. Гибридный микромакроэволюционный подход к реконструкции генного дерева. J Comput Biol. 2006. 13: 320–35.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 69.

    Кунтнер М., Арнедо М.А., Тронтель П., Локовшек Т., Агнарссон И. Молекулярная филогения пауков-нефилидов: эволюционная история модельной линии. Mol Phylogenet Evol. 2013; 69: 961–79.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 70.

    Cheng R-C, Kuntner M. Филогения предполагает ненаправленную и изометрическую эволюцию полового размерного диморфизма у пауков-аргиопинов: ненаправленная и изометрическая эволюция SSD. Эволюция.2014; 68: 2861–72.

    Артикул PubMed Google Scholar

  • 71.

    Воллрат Ф., Мадсен Б., Шао З. Влияние условий прядения на механику шелка драглайна паука. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 2001; 268: 2339–46.

    CAS Статья Google Scholar

  • 72.

    Paradis E, Claude J, Strimmer K. APE: Анализ филогенетики и эволюции на языке R.Биоинформатика. 2004; 20: 289–90.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 73.

    Rising A, Hjälm G, Engström W., Johansson J. N-концевой неповторяющийся домен, общий для белков шелка пауков драглайнов, жгутиковых и цилиндрических форм. Биомакромолекулы. 2006; 7: 3120–4.

    CAS Статья PubMed Google Scholar

  • 74.

    Рабочий RW. Размеры, двойное лучепреломление и поведение при силовом удлинении основных и второстепенных ампулатных шелковых волокон пауков, прядущих круговую паутину, — влияние смачивания на эти свойства.Текст Res J. 1977; 47: 650–62.

    Артикул Google Scholar

  • Недавние наблюдения бабочек — wisconsinbutterflies.org

    Авг 12
    Cynthia Bridge

    Расположение: Bittersweet Pl Home
    округ Дейн

    Шкипер с серебряными пятнами

    Шкипер Пека

    Шкипер Пека

    Капуста белокочанная

    Шкипер Пека

    Авг 12
    Итан Браун

    Расположение: Частная ферма
    Кроуфорд Каунти

    Авг 12
    Итан Браун

    Местоположение: Степи Голубой реки
    Графство Грант

    Черный и желтый Argiope

    Авг 12
    Итан Браун

    Местонахождение: Сад святилища Леди Гваделупской
    La Crosse County

    Авг 12
    Бет Стетенфельд

    Расположение: Мой двор и сад
    Dane County

    Шкипер с серебряными пятнами

    Мутная сера

    Мутная сера

    Авг 12
    Мэри Джо Сандлинг

    Расположение: Мои сады в Стоутоне
    Dane County

    Шкипер с серебряными пятнами

    Монарх

    Колибри с рубиновым горлом

    Авг 12
    Майк Риз

    Расположение: Pleasant Valley Conservancy SNA.
    округ Дейн

    Авг 12
    Майк Риз

    Расположение: Парк округа Фестге
    округ Дейн

    Авг 12
    Джилл Мертенс

    Расположение: город Манитовок
    Manitowoc County

    Шкипер Пека

    Авг 12
    Рут Смит

    Расположение: Rettenmund Prairie
    Dane County

    Монарх

    Мутная сера

    Роздик пестрый

    Авг 12
    Центр городской экологии

    Расположение: Риверсайд Парк (Центр городской экологии)
    Милуоки Каунти

    Вопросительный знак

    Наименьший шкипер

    Вопросительный знак

    Авг 12
    Кари Лендрам

    Место: Остров Менаша Доти, недалеко от реки Киз-стрит.
    Winnebago County

    Монарх

    Восточный тигровый махаон

    Авг 12
    Памела Скаар

    Расположение: район Yahara Park Place, Мэдисон.
    округ Дейн

    Авг 11
    Девин Корбин

    Расположение: южная окраина городка Берчвуд.
    Washburn County

    Монарх

    Северный Полумесяц

    Луговой рябчик

    Луговой рябчик

    Восточнохвостый голубой

    Авг 11
    Итан Браун

    Расположение: Придорожный
    Richland County

    Авг 11
    Итан Браун

    Локация: Частная ферма возле Солдатской рощи.
    Кроуфорд Каунти

    Авг 11
    Мэри Джо Сандлинг

    Расположение: Мой сад на заднем дворе в Стоутоне.
    Dane County

    Американский щегол

    Авг 11
    Итан Браун

    Расположение: заповедник Spring Green
    Округ Айова

    Авг 11
    Донна М. Уильямс-Рихтер

    Расположение: Muscallounge Road, недалеко от Битауна.
    Графство Грант

    Фритилляр с серебряной каймой

    Шкипер с серебряными пятнами

    Восточный тигровый махаон

    Авг 11
    К.Ява

    Расположение: Crex Meadows SWA-Murphy’s Rd.
    Округ Бернетт

    Роздик пестрый

    Северный Полумесяц

    Авг 11
    Пэм Кэмпбелл

    Расположение: Dunnville Barrens
    округ Данн

    Авг 10
    Итан Браун

    Локация: Частная ферма возле Солдатской рощи.
    Кроуфорд Каунти

    Авг 10
    Итан Браун

    Расположение: Зона дикой природы Авока.
    Округ Айова

    Авг 10
    Керстин Перретт

    Расположение: Государственный природный заповедник Даннвилл-Барренс
    округ Данн

    Роздик пестрый

    Авг 10
    Майк Риз

    Расположение: Pleasant Valley Conservancy SNA.
    Dane County

    Авг 10
    Шенон Фельц

    Расположение: Хэтли
    Округ Марафон

    Красно-пятнистый Фиолетовый

    Авг 10
    Рори Уильямс

    Расположение: петля по озерной тропе
    Winnebago County

    Авг 9
    Девин Корбин

    Расположение: южная окраина городка Берчвуд.
    Washburn County

    Восточнохвостый голубой

    ‘Лето’ Весна Лазурь

    Большой блестящий рябчик

    Ширококрылый шкипер

    Северный Полумесяц

    Авг 9
    Стив Киньон

    Расположение: заповедник дикой природы Spaulding Fen
    округа Джексон

    Шкипер Пека

    Фритилляр с серебряной каймой

    Белый Адмирал

    Фритилляр с серебряной каймой

    Адмирал с красными пятнами

    Белый Адмирал

    ‘Лето’ Весна Лазурь

    Авг 9
    Нэнси Меске

    Расположение: Парк Дороти Карнс
    Джефферсон Каунти

    Восточнохвостый голубой

    Шкипер с серебряными пятнами

    Монарх

    Восточнохвостый голубой

    Лесная нимфа обыкновенная

    Мутная сера

    Черный Махаон

    Жемчужный полумесяц

    Восточнохвостый голубой

    Viceroy

    Восточный тигровый махаон

    зр мотылька

    Авг 9
    Шенон Фельц

    Расположение: Хэтли
    Округ Марафон

    Гигантский парусник

    Авг 9
    Итан Браун

    Расположение: различные места в сельской местности.
    Саук Каунти

    Авг 9
    Итан Браун

    Расположение: Авока-Прери и Саванна.
    Округ Айова

    Авг 9
    Мэри Джо Сандлинг

    Расположение: в моем дворе в Стоутоне
    Dane County

    Шкипер с серебряными пятнами

    Монарх

    Монарх

    Капуста белокочанная

    Авг 9
    Пэм Кэмпбелл

    Расположение: Dunnville Barrens
    округ Данн

    Racerunner с шестью облицовками

    Шкипер Леонарда

    Проколотый тигровый жук

    Восточная свиноносая змея

    Авг 9
    Брук Л.Джилли

    Расположение: Центр природы Вер
    Милуоки Каунти

    Шкипер с тонкими краями

    Шкипер с тонкими краями

    Авг 8
    Бет Стетенфельд

    Расположение: сад МакФарланд
    Dane County

    Восточный тигровый махаон

    Монарх

    Авг 8
    Райан Брэди

    Местоположение: Мой дом к западу от Уошберна.
    Bayfield County

    Авг 8
    Мэри Майерс

    Местонахождение: Подразделение поместья, Женевское озеро.
    Уолворт Каунти

    Гигантский парусник

    Гигантский парусник

    Авг 8
    Терри Мортье

    Расположение: Государственный парк Уиллоу-Ривер
    ул.Croix County

    Шкипер Пека

    Наименьший шкипер

    Авг 8
    Кейт Редмонд

    Расположение: мигрирующий заповедник Форест-Бич
    Округ Озауки

    Лазурно-голубой

    Черный Махаон

    Монарх

    Восточнохвостый голубой

    Авг 8
    Дуг Кизер

    Расположение: Семейный дом, Neillsville
    Clark County

    Гигантский парусник

    Авг 8
    Майк Риз, Карен Оберхаузер

    Расположение: UW Arboretum — Grady Tract
    Dane County

    Holcocephala calva

    Holcocephala abdominalis

    Авг 8
    Пэм Кэмпбелл

    Расположение: Red Cedar Trail к югу от Ирвингтона.
    округ Данн

    Комбайн

    Комбайн

    Наименьший шкипер

    Луговой рябчик

    Viceroy

    Восточный тигровый махаон

    Авг 8
    Джилл Мертенс

    Расположение: город Манитовок
    Manitowoc County

    Шкипер Пека

    Красный Адмирал

    Авг 8
    Джудит Хуф

    Место: Мой сад в заливе Уайтфиш
    Милуоки Каунти

    Красный Адмирал

    Шкипер с серебряными пятнами

    Монарх

    Черный Махаон

    ‘Лето’ Весна Лазурь

    Капуста белокочанная

    Авг 8
    Линн Эриксон

    Расположение: город Марион, недалеко от плотины Касл Рок.
    Джуно Каунти

    Гигантский парусник

    Большой блестящий рябчик

    Комптон черепаховый

    Авг 8
    Лес Хоффман

    Расположение: Comanche Glen Madison 53704
    Dane County

    Шкипер Пека

    Авг 8
    Рич Каль и Лори Яр

    Расположение: Curtis Prairie UW Arb
    Dane County

    Авг 8
    Пэм Киндски

    Расположение: Белойт, Висконсин
    Рок Каунти

    Авг 8
    Рэндалл и Лисса Кемпер

    Расположение: Huckleberry Road Princeton Wi
    Округ Грин-Лейк

    Шкипер с серебряными пятнами

    Авг 8
    Питер и Шарлотта Сильверс

    Расположение: Озерный край прерии заповедник (озеро Рипли)
    Джефферсон Каунти

    Лесная нимфа обыкновенная

    Шкипер с серебряными пятнами

    Восточный тигровый махаон

    Восточнохвостый голубой

    Жемчужный полумесяц

    Монарх

    Viceroy

    Авг 8
    Лори Хэнсон

    Расположение: пешеходная дорожка на острове Террелл.
    Winnebago County

    Наименьший шкипер

    Наименьший шкипер

    Авг 7
    Пэм Киндски

    Расположение: Белойт, Висконсин
    Рок Каунти

    Авг 7
    Мэри Джо Сандлинг

    Расположение: в моем дворе в Стоутоне
    Dane County

    Восточный тигровый махаон

    Авг 6
    Стив Киньон

    Расположение: Форт Маккой, Пепельная дорога
    округ Монро

    Гигантский парусник

    Лесная нимфа обыкновенная

    Восточнохвостый голубой

    Северный Полумесяц

    Полосатая прическа

    Dun Skipper

    Dun Skipper

    Коричневый глаз

    Афродита Fritillary

    Белый Адмирал

    ★ = Новый рекорд графства

    Авг 6
    Хейли Крамер

    Расположение: в полумиле к востоку от марафон-сити на территории церкви Св.Центр духовности Антония
    Округ Марафон

    Фритилляр с серебряной каймой

    Авг 6
    Терри Мортье

    Расположение: Crex Meadows
    Округ Бернетт

    Шкипер Леонарда

    Шкипер Леонарда

    Сера розовая, сера оранжевая

    Пурпурный Fritillary

    Авг 6
    Терри Мортье

    Расположение: Stolte rd, Fish Lake SWA
    Округ Бернетт

    Дайнти Сера

    ‘Karner’ Мелисса Блю

    Авг 6
    Итан Браун

    Расположение: По соседству
    Округ Озауки

    Авг 6
    Итан Браун

    Расположение: природный заповедник Меквон
    Округ Озауки

    Авг 6
    Дебра Доуэн

    Расположение: Fox River Shores E.
    Округ Грин-Лейк

    Красный Адмирал

    Авг 6
    Рич Каль и Лори Яр

    Расположение: IAT — Jct Area, CTH PD
    Dane County

    Обычный клетчатый шкипер

    Авг 6
    Мэри Роэн

    Расположение: 805 Glover Road, River Falls, WI
    Округ Сент-Крус

    Шкипер с тонкими краями

    ★ = Новая запись о посещении округа
    ☆ = Новая запись о посещении округа

    Авг 6
    Крис Брандт

    Расположение: озеро Элкхарт
    Уезд Шебойган

    Восточный тигровый махаон

    Восточный тигровый махаон

    Авг 6
    Фред Дайк

    Расположение: Джексон Лендинг
    Dane County

    Авг 6
    Марси О’Коннор

    Расположение: Prairie Haven
    Buffalo County

    Обычный клетчатый шкипер

    Авг 6
    Пэт Фоджут

    Расположение: Центр природы Вер, Франклин, Висконсин
    Милуоки Каунти

    Шкипер Пека

    Авг 6
    Кейт Редмонд

    Местонахождение: Государственная природная территория Еловое болото.
    Fond du Lac County

    Наименьший шкипер

    Северный янтарный шмель

    Авг 5
    Майк Риз

    Расположение: Rocky Run Oak Savanna SNA
    округ Колумбия

    Авг 5
    Фред Дайк

    Расположение: Парк Дональда
    Dane County

    Авг 5
    Мэри Джо Сандлинг

    Расположение: Мои сады в Стоутоне
    Dane County

    Монарх

    Восточный тигровый махаон

    Шкипер с серебряными пятнами

    Авг 5
    Рори Уильямс

    Место: Тропа ледникового периода Морены Чайника
    Вашингтон Каунти

    Авг 5
    Итан Браун

    Расположение: По соседству
    Округ Озауки

    Авг 5
    Итан Браун

    Расположение: задний двор в Меквоне
    Округ Озауки

    Авг 5
    Итан Браун

    Расположение: Природный центр Ретцера
    Waukesha County

    Авг 5
    Роберт Олсон

    Расположение: Wyeville WI.
    округ Монро

    Большой блестящий рябчик

    Шкипер с серебряными пятнами

    ★ = Новый рекорд графства

    Авг 5
    Лори Стивенс

    Расположение: Бристоль
    Уезд Кеноша

    Монарх

    Монарх

    Авг 5
    Памела Скаар

    Расположение: Молодежный и заповедный парк Маккарти.
    Dane County

    Авг 5
    Бет Стетенфельд

    Расположение: заповедник Эдны Тейлор, Мэдисон
    Dane County

    Монарх

    Авг 5
    Джудит Хуф

    Местонахождение: Ботанический сад Бурнера.
    Милуоки Каунти

    ‘Лето’ Весна Лазурь

    Шкипер Пека

    Шкипер с тонкими краями

    Колибри Чистокрылое (мотылек)

    Восточный тигровый махаон

    Восточный тигровый махаон

    Шкипер с тонкими краями

    Комбайн

    Мутная сера

    Авг 5
    Питер и Шарлотта Сильверс

    Местонахождение: Патрик Марш, Сан-Прери
    Dane County

    Восточнохвостый голубой

    Черный Махаон

    Авг 5
    JE Cooper

    Расположение: район Медоу Валтон
    Саук Каунти

    Жемчужный полумесяц

    Лесная нимфа обыкновенная

    Лесная нимфа обыкновенная

    Большой блестящий рябчик

    Монарх

    Авг 4
    Кейт Редмонд

    Расположение: заповедник Озоки Вашингтон Лэнд Траст Лейк Двенадцать
    Вашингтон Каунти

    Фритилляр с серебряной каймой

    Авг 4
    Майк Риз

    Расположение: Ботанический сад Ротари.
    Рок Каунти

    Авг 4
    Карл и Дороти Леглер

    Расположение: Нижняя река Вис: несколько остановок между Готэмом и Блю-Ривер.
    Richland County

    Наименьший шкипер

    Шкипер с тонкими краями

    Гигантский парусник

    ★ = Новая запись о посещении округа
    ☆ = Новая запись о посещении округа

    Авг 4
    Рич Каль и Лори Яр

    Расположение: Hopkins Rd. Прерия, Гусиный пруд
    Dane County

    Восточнохвостый голубой

    Авг 4
    Линн Эриксон

    Расположение: город Марион / возле плотины Касл Рок
    Джуно Каунти

    Большой блестящий рябчик

    Восточный тигровый махаон

    Авг 4
    Рори Уильямс

    Расположение: к югу от Country Club и Z
    Winnebago County

    Авг 4
    Мэри Джо Сандлинг

    Расположение: Мой двор и сады в Стоутоне
    Dane County

    Монарх

    Монарх

    Шкипер с серебряными пятнами

    Монарх

    Авг 4
    Дэйв Хогг

    Расположение: Сад бабочек в резиденции в Воунаки.
    Dane County

    Авг 4
    Итан Браун

    Местонахождение: Северная морена котла.
    Fond du Lac County

    Авг 4
    Скотт и Энн Свенгель

    Местонахождение: Болото Шенеберг
    округ Колумбия

    Авг 4
    Кэти Кашевич

    Расположение: открытое поле на Дэвис-роуд.к югу от Fifield
    Прайс Каунти

    Авг 4
    Джудит Хуф

    Расположение: Природный центр Schlitz Audubon
    Милуоки Каунти

    Лесная нимфа обыкновенная

    Комптон черепаховый

    Комптон черепаховый

    Восточный тигровый махаон

    Монарх

    Шкипер с серебряными пятнами

    Авг 4
    Линн Эриксон

    Расположение: город Марион, недалеко от плотины Касл Рок.
    Джуно Каунти

    Гигантский парусник

    Гигантский парусник

    Авг 3
    Боб Лири

    Расположение: Поле для гольфа Lawsonia
    Округ Грин-Лейк

    ☆ = Новый рекорд наблюдений за округом

    Авг 3
    Дан Абель

    Расположение: лесная тропа, заросшая бревнами, к северу от озера Стивенс, улица Элвина.
    Лесной округ

    Авг 3
    Рич Каль и Лори Яр

    Расположение: Gates Lake Rd.К западу от озера Райли SNA
    Прайс Каунти

    Белый Адмирал

    Dun Skipper

    Тысячелистник обыкновенный

    Канада Дарнер

    Канада Дарнер

    Dun Skipper

    Белый Адмирал

    Atlantis Fritillary

    Афродита Fritillary

    Авг 3
    Фред Дайк

    Расположение: Waltham Park
    Dane County

    Оранжевая сера

    Наименьший шкипер

    Фритилляр с серебряной каймой

    Шкипер Пека

    Шкипер Пека

    Монарх

    Наименьший шкипер

    Мутная сера

    Восточнохвостый голубой

    Авг 3
    Майк Риз

    Расположение: Зона дикой природы Авока.
    Округ Айова

    Сонный апельсин

    Авг 3
    Персонал природных территорий округа Милуоки

    Расположение: Estabrook Park
    Милуоки Каунти

    Монарх

    Шкипер с серебряными пятнами

    Шкипер Пека

    Авг 3
    Нэнси Меске

    Расположение: Парк Nature Hill
    Waukesha County

    Наименьший шкипер

    Восточная запятая

    Восточная запятая

    Восточная запятая

    Наименьший шкипер

    Авг 3
    Мэри Роэн

    Расположение: 805 Glover Road
    ул.Croix County

    Шкипер Пека

    Северный Полумесяц

    Авг 3
    Памела Скаар

    Расположение: New Glarus Woods SP
    Грин Каунти

    Авг 3
    Фред Дайк

    Расположение: Hay Ln
    Округ Айова

    Наименьший шкипер

    Большой блестящий рябчик

    ‘Лето’ Весна Лазурь

    Большой блестящий рябчик

    Авг 3
    Итан Браун

    Расположение: природный заповедник Меквон
    Округ Озауки

    Авг 3
    Итан Браун

    Расположение: По соседству
    Округ Озауки

    Авг 3
    Мэри Джо Сандлинг

    Расположение: тропа реки Яхара в Стоутоне.
    Dane County

    Красный Адмирал

    Капуста белокочанная

    Монарх

    Авг 3
    Питер и Шарлотта Сильверс

    Расположение: наш задний двор, Лейк-Миллс
    Джефферсон Каунти

    Монарх

    Восточный тигровый махаон

    Авг 3
    Джон Маккоу

    Расположение: Лейк-Парк
    Милуоки Каунти

    Шкипер с серебряными пятнами

    Красный Адмирал

    Авг 3
    Роб Пендергаст

    Расположение: луга Буэна-Виста.
    Portage County

    ‘Лето’ Весна Лазурь

    Северный Полумесяц

    Мутная сера

    Восточнохвостый голубой

    Viceroy

    ‘Лето’ Весна Лазурь

    Авг 2
    Скотт и Энн Свенгель

    Расположение: луга Буэна-Виста.
    Portage County

    Авг 2
    Майк Риз

    Местонахождение: Ботанический сад Ольбриха
    Dane County

    Красный Адмирал

    Большое распростёртое крыло

    Большое распростёртое крыло

    Авг 2
    Фред Дайк

    Расположение: заповедник Spring Green
    Саук Каунти

    Обычный шкипер на обочине дороги

    Обычный шкипер на обочине дороги

    Американская медь

    Шкипер с серебряными пятнами

    Монарх

    Большой песчаный тигровый жук

    Proctacanthus hinei

    Авг 2
    Фред Дайк

    Расположение: нижняя часть реки Висконсин.
    Округ Айова

    Сонный апельсин

    Восточнохвостый голубой

    Сонный апельсин

    Монарх

    Мутная сера

    Авг 2
    Карл и Дороти Леглер

    Расположение: в нескольких остановках от пристани для лодок Вудмана до лодочной пристани Глен-Хейвен.
    Графство Грант

    Шкипер с серебряными пятнами

    Восточный тигровый махаон

    Восточный тигровый махаон

    Гигантский парусник

    Авг 2
    Брэди Шутц

    Расположение: природная зона штата Мэйден-Рок
    Пепин уезд

    Восточный тигровый махаон

    ★ = Новый рекорд графства

    Авг 2
    Памела Скаар

    Расположение: Парк округа Яхара-Хай, Воунаки
    Dane County

    Авг 2
    Мэри Роэн

    Расположение: 805 Glover Road, River Falls, WI
    ул.Croix County

    Восточный тигровый махаон

    Авг 2
    Лори Хэнсон

    Расположение: заповедник водно-болотных угодий Хекродт
    Округ Отагэми

    Шкипер с серебряными пятнами

    Авг 2
    Мэри Джо Сандлинг

    Расположение: вдоль троп в государственном парке озера Кегонса недалеко от Стаутона.
    Dane County

    Viceroy

    Капуста белокочанная

    Восточный тигровый махаон

    Авг 2
    Билл и Джинни Нельсон

    Расположение: Парк округа Стюарт-Лейк
    Dane County

    Авг 2
    Итан Браун

    Местонахождение: Государственный лес Кеттл Морейн — Северный блок.
    Fond du Lac County

    Авг 2
    Алес Веллфаст

    Расположение: Лейквью Хилл Парк и Уорнер Парк Мэдисон.
    Dane County

    Восточный тигровый махаон

    Восточнохвостый голубой

    Жемчужный полумесяц

    Авг 2
    D Nussbaum

    Расположение: 37-я авеню.
    Округ Ваушара

    Гигантский парусник

    Авг 2
    Майк Дауд

    Расположение: Хок-Айленд-роуд. Black River Falls
    округа Джексон

    Лесная нимфа обыкновенная

    Афродита Fritillary

    Красно-пятнистый Фиолетовый

    Лесная нимфа обыкновенная

    Афродита Fritillary

    Авг 2
    Персонал природных территорий округа Милуоки

    Расположение: Oak Creek PKWY Section 8.
    Милуоки Каунти

    Шкипер Пека

    Авг 2
    Персонал природных территорий округа Милуоки

    Расположение: Oak Creek PKWY Section 15.
    Милуоки Каунти

    Восточный тигровый махаон

    Авг 2
    Персонал природных территорий округа Милуоки

    Расположение: Oak Creek Pkwy, секция 13.
    Милуоки Каунти

    Жемчужный полумесяц

    ‘Лето’ Весна Лазурь

    Шкипер с серебряными пятнами

    Гусеница Монарх

    Авг 2
    Майк Дауд

    Расположение: Хок-Айленд-роуд, водопад Блэк-Ривер
    округа Джексон

    Гигантский парусник

    Гигантский парусник

    Авг 2
    AR Cowjak

    Расположение: городок Шерман
    округ Данн

    Авг 1
    Терри Мортье

    Расположение: Грязевое озеро, графство Дуглас
    округ Дуглас

    Зеленая запятая

    Зеленая запятая

    Авг 1
    Линн Эриксон

    Расположение: город Марион, недалеко от плотины Касл Рок.
    Джуно Каунти

    Северный жемчуг

    Авг 1
    Терри Мортье

    Расположение: обочины в районе озера Амникон, графство Дуглас.
    округ Дуглас

    Сера с розовой кромкой

    Фритилляр с серебряной каймой

    Viceroy

    Мутная сера

    Черепаховый панцирь Милберта

    Фритилляр с серебряной каймой

    Авг 1
    Терри Мортье

    Расположение: Crex Meadows
    Округ Бернетт

    Коралловая прическа

    Черный Махаон

    Прическа Эдвардса

    Капуста белокочанная

    Пурпурная медь

    Авг 1
    Итан Браун

    Расположение: заповедник Львиное ущелье.
    Округ Озауки

    Авг 1
    Пэт Дусс

    Расположение: округ Чиппева
    Округ Чиппева

    Большой блестящий рябчик

    Авг 1
    Билл и Джинни Нельсон

    Расположение: Парк Уокинг Айрон Каунти
    Dane County

    Авг 1
    Джоан Рикерт

    Расположение: мой двор, сельский Медфорд
    Округ Тейлор

    Комбайн

    Авг 1
    Пегги Ааре

    Расположение: юго-западный угол городка Святого Лаврентия.
    Waupaca County

    Гигантский парусник

    Авг 1
    Майк Риз

    Расположение: Зона дикой природы Авока.
    Округ Айова

    Авг 1
    Энн Теринг

    Расположение: Мой сад
    Dane County

    Авг 1
    Питер и Шарлотта Сильверс

    Расположение: Государственный парк губернатора Доджа
    Округ Айова

    Гигантский парусник

    Жемчужный полумесяц

    Большой блестящий рябчик

    Авг 1
    Джон Маккоу

    Расположение: Центр природы Вер
    Милуоки Каунти

    Дикий индиго Сумеречный крыло

    Шкипер с тонкими краями

    Восточный тигровый махаон

    Капуста белокочанная

    Большой блестящий рябчик

    Шкипер Пека

    Дикий индиго Сумеречный крыло

    Шкипер Пека

    Шкипер Пека

    Шкипер Пека

    Dun Skipper

    Авг 1
    Джудит Хуф

    Расположение: Мой сад в Уайтфиш-Бэй
    Милуоки Каунти

    Шкипер с серебряными пятнами

    Колибри с рубиновым горлом

    Монарх

    Красный Адмирал

    Шкипер Пека

    Капуста белокочанная

    Июл 31 год
    Брук Л.Джилли

    Расположение: заповедник «Охрана природы ледниковых озер»
    Уезд Шебойган

    Гикори Прическа

    ★ = Новая запись о посещении округа
    ☆ = Новая запись о посещении округа

    Июл 31 год
    Билл и Джинни Нельсон

    Расположение: Сельскохозяйственная станция West Madison.
    Dane County

    Июл 31 год
    Дин Хансен

    Расположение: Crex Meadows SWA
    Округ Бернетт

    Proctacanthus milbertii

    Афродита Fritillary

    Афродита Fritillary

    Большой блестящий рябчик

    Большой блестящий рябчик

    ‘Karner’ Мелисса Блю

    Прическа Эдвардса

    Сера с розовой кромкой

    Черный Махаон

    Июл 31 год
    Дин Хансен

    Расположение: Fish Lake SWA
    Округ Бернетт

    Восточный тигровый махаон

    Восточный тигровый махаон

    Пурпурная медь

    Колибри Чистокрылое (мотылек)

    Dun Skipper

    Монарх

    Лесная нимфа обыкновенная

    Коричневый глаз

    Viceroy

    ‘Karner’ Мелисса Блю

    ‘Karner’ Мелисса Блю

    ‘Karner’ Мелисса Блю

    Восточный тигровый махаон

    Июл 31 год
    Бабетта Кис

    Расположение: Barnes Prairie
    Racine County

    ‘Лето’ Весна Лазурь

    ‘Лето’ Весна Лазурь

    Июл 31 год
    Майк Риз, Эдгар Сполдинг

    Расположение: UW Madison Arboretum, недалеко от центра для посетителей.
    Dane County

    Июл 31 год
    Линн Эриксон

    Расположение: город Марион, недалеко от плотины Касл Рок.
    Джуно Каунти

    Шкипер с серебряными пятнами

    Гигантский парусник

    Июл 31 год
    Итан Браун

    Расположение: Cedarburg Bog
    Округ Озауки

    Июл 31 год
    Фред Дайк

    Расположение: Kalscheur Savanna
    Округ Айова

    Июл 31 год
    Девин Корбин

    Расположение: собственность заповедника Бивер-Крик в городке Лудингтон.
    Округ О-Клэр

    ‘Karner’ Мелисса Блю

    ‘Karner’ Мелисса Блю

    Июл 31 год
    Итан Браун

    Расположение: задний двор
    Округ Озауки

    Июл 31 год
    Итан Браун

    Расположение: В окрестностях
    Округ Озауки

    Июл 31 год
    Энн Теринг

    Расположение: Мой сад
    Dane County

    Июл 31 год
    Розовые галстуки

    Расположение: Дом в Онейде
    Округ Отагэми

    Гигантский парусник

    Июл 31 год
    Мэри Джо Сандлинг

    Расположение: Мой двор и сады в Стоутоне
    Dane County

    Восточный тигровый махаон

    Июл 31 год
    Джудит Хуф

    Расположение: Лейк-Парк
    Милуоки Каунти

    Шкипер Пека

    ‘Лето’ Весна Лазурь

    Шкипер Пека

    Восточный тигровый махаон

    Шкипер Пека

    Июл 31 год
    Рори Уильямс

    Расположение: к востоку от Чехии и город N
    Округ Ваушара

    Аппалачский коричневый

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *